广义的衰老是生物体从受精卵到老年的个体发育史,是随时间的推移而表现出一种结构和机能衰退的自发性必然过程。常伴随着细胞分裂分化能力降低、组织和器官氧化损伤加剧、抗氧化能力减弱、繁殖能力下降等特征的出现。蚤状溞(Daphnia pulex)是一种常见的全球性分布的淡水枝角类浮游动物,在淡水水产养殖中,常被作为鱼虾等经济种类的重要活体饵料而被广泛培养。蚤状溞生命周期中具有两种生殖方式,即无性生殖(孤雌生殖)和有性生殖(两性生殖),当环境条件适合其生长时,通常进行孤雌生殖,在短期内扩大种群的数量;反之,则进行有性生殖,产生的受精卵(休眠卵)能度过不良环境条件,以确保种群的延续。生长快、繁殖周期短等优点使其成为研究衰老生物学的一种实验动物。本文以蚤状溞为研究对象,从蛋白质组学、形态学、酶学、分子生物学等多个角度,探讨蚤状溞衰老引起相关的宏观与微观变化,以期能找到蚤状溞衰老的标志性变化,为蚤状溞衰老生物学的深入研究提供理论依据和实验佐证。1蚤状溞生长发育过程中的形态学变化蚤状溞卵孵出的幼体在生长的20天内,随着时间的延长,个体体长不断增加,20天后停止生长;25天后,部分个体出现萎缩现象。个体单次繁殖量在前20天,随着时间的延长而不断增加,20天后又逐渐减少,且个体逐渐死亡;25天后,个体死亡速度明显加快。本文借助扫描电镜观察蚤状溞生长不同时期的外部形态超微结构,结果表明,随着时间的延长,雄溞外部形态无明显变化,而雌性在28天时,背部出现明显的“塌陷”现象,其原因可能是生殖量减小导致的体壁萎缩现象,也是导致个体体长变短的原因之一。通过透射电镜观察蚤状溞不同时期性腺发育状况,个体衰老导致性腺内脂质数量减少,并出现空泡化现象,21天蚤状溞孤雌溞性腺内线粒体体积变大,且结构不完整,嵴结构发生明显断裂现象,且过氧化物酶体数目也显著变多。以上结果表明21天后的性腺较7天和14天,其性腺内部具有明显的衰老特征;其繁殖量的下降,极有可能是由于自身性腺老化所导致,且性腺的衰老时间明显早于个体外部形态的老化现象。2蚤状溞衰老相关酶学及分子生物学的初步研究通过相关酶活性的测定,发现随着蚤状溞个体衰老,酶活性总体均表现为下降趋势,这表明衰老过程中,抗氧化酶活性逐渐降低,导致机体中的活性氧(ROS)的大量积累,损伤细胞结构。在转录水平上,研究热休克蛋白家族基因(HSP70和HSP90)、多种抗氧化酶基因以及两性转化基因(Dsx)基因,结果显示衰老导致热休克蛋白和抗氧化酶基因表达量减少,而蚤状溞Dsx基因则呈现先升高后下降的趋势,并在第15天时到达最大值,表明15天后,个体发生生殖模式转化的可能性在增大。根据转录组结果,本文克隆了蚤状溞几丁质酶基因(DpChit),全长共1723bp,开放阅读框(ORF)为1371bp,编码456个氨基酸残基;同源性比对和系统进化树的结果表明,甲壳动物与昆虫之间的亲缘最为接近;通过实时荧光定量PCR技术研究不同天数下DpChit基因表达量变化,结果显示随着天数的增加,DpChit基因呈现先增加后减少的趋势,表明衰老导致蜕壳能力减弱。上述结果表明随着天数的增加,蚤状溞体内过氧化物不断积累,抗氧化酶活性逐渐下降,细胞分裂能力减弱,20天后,蚤状溞蜕壳生长能力逐渐下降。3蚤状溞衰老相关的蛋白质组学分析蛋白质组学是在蛋白水平上,对基因的调节进行描述,对基因表达量进行测定,对基因表达调控的机制进行解释的一种生物信息学手段。蚤状溞衰老相关的蛋白质组学结果显示,在生长过程中,15天组主要表达蛋白质是有丝分裂相关蛋白,表明此时细胞分裂旺盛;20天与25天组则主要表现为过氧化反应,表明这时机体受到过氧化反应较重;从细胞定位角度分析,15天组主要是一些细胞质基质中的相关蛋白质表达,20和25天组则主要是脂质代谢表达相关蛋白;从分子功能角度分析,15天组表现为核糖体结构组分相关蛋白合成旺盛,20天之后个体主要体现为抗氧化与氧化还原酶的分子功能。以上结果表明,15天组相对于20天和25天两组,表现出生长旺盛,代谢速度快等特点;20天和25天组则表现为较明显的抗氧化过程,且脂质代谢有可能与个体衰老有较大关联作用。