R-(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸(D-HPPA)是合成芳氧苯氧基丙酸酯类(APP)除草剂的重要手性中间体,年需求量巨大。球孢白僵菌是可以进行多种生物催化反应,利用球孢白僵菌的羟基化反应以D-PPA为底物合成D-HPPA,不仅可以克服传统化学法和发酵法存在的缺点,而且还有着绿色高效,简单方便等优点。本文首先以球孢白僵菌出发菌株进行诱变以获得高底物耐性和高转化率的突变株,然后再对突变株进行包埋处理,并对其包埋条件及反应条件进行优化,以提高生物转化的反应速率和转化效率。本文的主要研究内容及结果如下:(1)以球孢白僵菌B2660为出发菌进行紫外诱变(紫外灯功率30 W)和等离子体诱变(工作气体为氦气;仪器功率为100 W;诱变距离为2 mm;气氦气流量为10 L/min)。紫外诱变时间为25 min,致死率为91.1%,经筛选和遗传稳定性检测后,得到高耐性突变株U07,此突变株将底物耐受性由10 g/L提升至100 g/L。以U07为出发菌再次进行等离子体诱变,诱变时间为120 s,致死率为92.8%,经筛选和遗传稳定性检测后,得到高转化突变株U07D63。在底物D-PPA浓度为50 g/L的溶液中进行生物转化合成产物D-HPPA,转化率为98.6%,平均生产强度为7.04 g/(L·d),较球孢白僵菌B2660的平均生产强度提高了7.65倍。(2)为解决菌株的凝集问题,并降低外界不良环境对菌体的影响,利用海藻酸钠和聚乙烯醇对球孢白僵菌进行包埋处理,并对其包埋剂浓度、交联剂浓度和交联时间进行优化。经优化实验后得到球孢白僵菌最适包埋条件:4%海藻酸钠和4.5%聚乙烯醇混合使用制成凝胶珠,再放入2.5%的氯化钙溶液中交联6 h。此包埋条件下,在60 g/L的底物浓度下进行生物转化,反应时间为6 d,产物浓度为56.7 g/L,转化率为94.5%,平均生产强度为9.45 g/(L·d),较游离状态下球孢白僵菌生物转化的反应时间减少了25%,平均生产强度提高了42.3%,转化率提高了6.8%。(3)为进一步提高突变株U07D63生物转化合成D-HPPA的反应速率和转化效率,对初始底物浓度、温度、p H及摇床转速进行优化。经优化实验后得到球孢白僵菌凝胶珠的最适反应条件:底物浓度为70 g/L,反应温度为28℃,反应p H为6.5,摇床转速为200 r/min。此反应条件下,反应时间为6 d,产物浓度为69.1 g/L,转化率为98.7%,平均生产强度为11.52 g/(L·d),凝胶珠可以重复利用四次,较对初始反应条件优化前的产物浓度提高了21.8%,平均生产强度提高了21.9%。通过对球孢白僵菌进行诱变和固定化处理后,不仅解决了生物转化过程中的实际问题,提高了生物转化的反应速率和转化效率,而且还为利用生物转化法合成D-HPPA提供了研究方向和理论依据。