【摘 要】
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稻瘟病严重危害水稻生长,影响全球水稻产量和品质。对水稻抗病机理进行剖析,挖掘水稻新型抗性基因,在不影响生产前提下增强水稻抗性,是水稻育种改良的重要方向。稻瘟病广谱抗性基因Pi63表现出持久的田间抗性,且不影响水稻的产量和品质。实验室前期研究表明,Pi63基因的表达受到稻瘟病侵染诱导,呈现明显的时空表达特异性,且水稻抗性与该基因表达量紧密相关。作为基因表达调控的关键元件——启动子序列在植物抗逆应答过
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稻瘟病严重危害水稻生长,影响全球水稻产量和品质。对水稻抗病机理进行剖析,挖掘水稻新型抗性基因,在不影响生产前提下增强水稻抗性,是水稻育种改良的重要方向。稻瘟病广谱抗性基因Pi63表现出持久的田间抗性,且不影响水稻的产量和品质。实验室前期研究表明,Pi63基因的表达受到稻瘟病侵染诱导,呈现明显的时空表达特异性,且水稻抗性与该基因表达量紧密相关。作为基因表达调控的关键元件——启动子序列在植物抗逆应答过程尤为关键,生物信息学分析结果表明Pi63启动子序列富含植物抗病应答调控元件,将启动子分为P0-P3共4个缺失片段并构建成功。本研究拟通过构建Pi63酵母单杂交文库,以酵母单杂交技术筛选与稻瘟病抗性基因Pi63启动子序列互作的反式作用因子,并对筛选到的蛋白进行验证,为阐明Pi63启动子调控机理,研究作物免疫与产量间的平衡机制奠定基础。本研究取得主要结果如下:（1）水稻叶片活体接种稻瘟病菌,混合取样构建Pi63酵母单杂交文库。文库滴度为:2.15×10~9cfu/mL,文库平均插入片段为500～2000bp,重复继代培养后重组质粒仍能稳定存在菌体中,表明该酵母单杂交文库构建成功,可用于后期文库筛选。将4个Pi63启动子缺失片段序列构建至pAbAi诱饵载体中,重组质粒转化酵母感受态细胞中,经过阳性鉴定获得4个酵母单杂交诱饵菌株。（2）对上述构建的4个诱饵菌株,进行酵母单杂交文库筛选,共筛选获得可能与Pi63启动子序列的调控元件存在相互作用的25个蛋白。在点对点回复验证实验中,发现1号,4号,5号以及12号蛋白表现出与启动子片段的强相互作用,WIH1类似蛋白分子的1号蛋白以及类金属硫蛋白的5号蛋白均为富含半胱氨酸蛋白家族,参与植物免疫应答;4号蛋白为未定义的蛋白分子;12号蛋白为醛氧脱氢酶家族蛋白,参与植物多种信号通路。此外还表明这些蛋白与Pi63启动子上调控元件相互作用主要位于P0至P1的序列中,与预期调控元件定位相符。（3）将酵母单杂交点对点回复验证中的1号,4号以及5号蛋白,成功构建至蛋白表达载体pGEX-6p-1中,成功诱导获得可溶性的融合蛋白。利用覆盖Pi63启动子的三条探针序列进行EMSA实验,成功验证了1号蛋白与4号蛋白与调控元件的相互作用。筛选获得的1号蛋白能与Pi63启动子上游区域的GCCCORE元件,CATATGGMSAUR元件,BIHD1OS元件结合,参与JA所介导的抗病应答过程;4号蛋白分子虽然尚未有相关研究,但实验结果表明该蛋白可以与GCCCORE元件,ASF1MOTIFCAMV元件,CGCGBOXAT元件和BIHD1OS元件结合。
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