论文部分内容阅读
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种引起中枢神经损害的急性人兽共患病。每年全球接近59000人死于狂犬病,我国是狂犬病的高发地区之一。狂犬病一旦发病致死率几乎100%,目前尚无有效的治疗方法,而接种疫苗是目前预防狂犬病的最高效的方法。狂犬病病毒由5种结构蛋白以及单股负链RNA构成。糖蛋白位于细胞膜表面,是目前发现狂犬病病毒中唯一一种可以诱导机体产生中和抗体（Virus-neutralizing antibody,VNA）的蛋白。有研究表明,Tenascin C中的FBG结构域可以结合并激活Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）,基于本实验室之前的研究发现TLR4佐剂可以显著提高狂犬疫苗的免疫效果,我们推测Tenascin C也可用作狂犬疫苗的佐剂。为了探索Tenascin C的FBG结构域对于狂犬病病毒感染机体引起的免疫应答的影响,我们通过反向遗传操作构建了表达Tenascin C-FBG结构域的重组狂犬病病毒LBNSE-FBG-C,并对该重组病毒在体内外的基本特性进行了研究。首先在亲本狂犬病病毒LBNSE的G和L蛋白中间位置插入Tenascin C蛋白的FBG结构域,通过反向遗传操作系统构建并拯救表达Tenascin C-FBG的重组病毒,命名为LBNSE-FBG-C。通过Western Blot验证插入基因的表达,并绘制重组病毒的多步生长曲线,表明外源基因Tenascin C-FBG的插入对病毒的增殖没有影响;在病毒致病性方面,将病毒以脑内途径注射小鼠后,小鼠无明显临床症状,且体重基本保持上升趋势,表明Tenascin C-FBG的表达对致病性影响较小。进一步研究Tenascin C-FBG的表达对免疫原性的影响机制,分离小鼠骨髓源树突状细胞（Dendritic cells,DC）,利用荧光定量PCR检测TLR4通路下游的炎症因子,验证LBNSE-FBG-C可以体外激活小鼠树突状细胞中的TLR4通路。最后研究LBNSE-FBG-C在小鼠体内作为灭活疫苗的效果,发现LBNSE-FBG-C可以产生更高的VNA。而重组病毒对于成年小鼠致病性的影响,我们分别用DMEM,LBNSE,LBNSE-FBG-C以脑内途径注射小鼠,小鼠均无明显临床症状,体重均保持上升趋势。此外,免疫灭活LBNSE-FBG-C的小鼠在感染50×LD50野毒株DRV-Mexico后存活率（90%）明显比LBNSE组存活率（50%）高。综上所述,LBNSE-FBG-C对于狂犬病病毒的体外生长特性基本无影响,可以激活TLR4通路,并能够快速提高机体产生中和抗体的水平,提高机体对于狂犬病病毒的保护能力。因此LBNSE-FBG-C可以作为更为有效的灭活疫苗的候选。