论文部分内容阅读
背景原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis,PBC）是以中年女性为主要发病人群的器官特异性自体免疫病,起病及发展隐匿,最终发展为肝硬化甚至肝癌。近些年来,发病率呈增加趋势,吸引了越来越多的研究者的注意。随着对疾病认识的不断提高,发现早期诊断、早期治疗和干预,对于PBC预后的提高有着重要的价值,特别是那些尚未出现典型临床症状的亚临床表现患者。PBC的早期诊断方法中,抗线粒体抗体（antimitochondrial antibody,AMA）是重要的诊断依据,特别是识别M2亚型的AMA是存在于PBC患者血清中的特异自身抗体类型,其识别的主要抗原表位位于丙酮酸脱氢酶E2亚基（PDC-E2）的内硫辛酰（inner lipoyl domain,ILD）区域,该区域生理情况下呈线型发夹状结构。然而,PBC患者中仍5～10%患者该抗体检测阴性。随着对蛋白质结构认识的逐渐提高,研究者发现在自然界中存在着几百种蛋白质结构不同于最多见的线形结构,而通过对这些环化蛋白的研究发现,这些环化的结构所具有的各方面的特性可能不同于常见的线形的结构,包括抗原性的变化。蛋白多肽环化的方式多种多样,而在体内进行蛋白的自发环化,并且不受氨基酸数目的影响,例如,内含肽（intein）介导的蛋白环化有两种方法分别是蛋白质反式剪接（protein trans-splicing,PTS）和表达蛋白连接（expressed protein ligation,EPL）,利用蛋白多肽的环化技术获取的环化蛋白,给蛋白多肽在生产生活中的应用提供了具大的空间。目前用于PBC患者AMA检测的抗原是PDC-E2中ILD,具有传统蛋白质常见的线形结构,PBC患者中检测的阳性率90～95%,通过蛋白多肽的环化技术,将ILD变成一种更稳定的环形结构,以探索环状结构改换对AMA检测的影响,至目前尚未见研究报道。目的本研究将选用EPL环化的方式获得PDC-E2的环状ILD（cyclized ILD,cILD）,并与天然状态下存在的线形结构的ILD相比较,探索其检测PBC患者AMA的临床意义。方法（1）构建环化质粒pTWIN1,用合成的引物序列（上游）:CACAACGGAAGAGCA TGCAAAAATTATACACTGGATTCCTCAG;引物序列（下游）:GATGCAGGAAGAGCTTAAATCTGTTACTTCGGTTGGCCT为引物,PCR获得ILD的cDNA,用2个Sap I酶双酶切PCR获得的ILD cDNA及环化质粒pTWIN1,DNA连接酶将ILD的cDNA插入环化质粒pTWIN1中,筛选插入成功的克隆并凝胶电泳和测序鉴定。（2）cILD的表达与纯化:利用双intein系统,环化质粒pTWIN1中表达PDC-E2的ILD并通过与几丁质树脂结合在柱剪切,纯化获取cILD。（3）通过质粒p GEX-4T表达并纯化获得线形PDC-E2的ILD。（4）采用免疫印迹（Western Blot,WB）实验鉴定纯化的目的蛋白的抗原性。（5）临床收集316例PBC患者血清、34例类风湿性关节炎（RA）患者血清以及36例健康人血清,分别以商用AMA-M2抗体检测试剂盒（以PDC-E2为包被抗原）、线状ILD及cILD作为包被底物,检测PBC患者、RA患者及健康对照的AMA。（6）比较3种包被抗原酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测入组PBC患者的AMA阳性率,特别是对包被抗原PDC-E2和线状ILD反应均阴性的PBC患者,统计这些患者对包被抗原cILD的反应情况。结果（1）获得PDC-E2蛋白中ILD的cDNA并成功构建到环化质粒pTWIN1中。（2）蛋白通过几丁质树脂亲和层析方法两步剪切标签蛋白,获得N端半胱氨酸,C端硫酯,自发形成环化反应获得首尾骨架环化的ILD蛋白。（3）获得纯化的线状ILD蛋白。（4）WB法鉴定2个通过原核表达、纯化获得的目的蛋白（线状和cILD）均具有与AMA结合的免疫原性。（5）3种包被抗原ELISA方法检测AMA的结果:PDC-E2、线状ILD和cILD作为包被抗原,检测PBC患者AMA的阳性率分别是93.04%（294/316）、91.46%（289/316）和85.76%（271/316）;包被抗原PDC-E2和线状ILD检测AMA的阳性率无显著差异（93.04%vs 91.46%,P=0.7437）;包被抗原cILD检测AMA阳性率显著低于包被抗原PDC-E2检测阳性率（85.76%vs 93.04%,P=0.0030）,也显著低于包被抗原为线状ILD检测阳性率（85.76%vs 91.46%,P=0.0242）;RA患者及健康对照者对3种包被抗原AMA检测阳性率均为0.00%。（6）PBC患者中PDC-E2和线形ILD作为包被抗原检测AMA均阴性的PBC患者共21例,用环形ILD检测出其中8例患者AMA阳性（阳性率为38.10%,8/21）,12例阴性（阴性率为61.90%,12/21）。结论（1）通过内含肽介导的蛋白环化工程成功获得PDC-E2中ILD首尾相连的cILD。（2）PDC-E2的抗原性主要存在ILD区域。（3）PBC的AMA检测中,与线状ILD比较,cILD的抗原性发生改变,cILD作为抗原虽然总AMA阳性下降,但新出现的抗原表位使其能从传统方法检测的AMA阴性中识别38.10%AMA阳性患者。（4）cILD作为包被抗原的ELISA检测法,在传统包被抗原ELISA法检测AMA阴性的PBC临床诊断中,可能具有新的临床诊断价值。