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肝移植已成为治疗各种终末期肝病的有效方法。供肝短缺问题制约着肝移植发展。心脏停搏供肝由于遭受热缺血损伤、冷保存损伤和再灌注损伤,在这一病理生理过程中Kupffer细胞被激活释放TNF-α等细胞因子引起微循环障碍,及肝细胞和内皮细胞受损是移植后原发性移植物无功能(primary nonfunction, PNF)的主要原因。通过一些措施减轻供肝缺血再灌注损伤,有效利用心脏停搏供肝是肝移植领域的研究热点。热休克蛋白做为细胞内源性保护蛋白,具有分子伴侣作用,抗氧化作用,协同免疫作用,抗细胞凋亡等作用,其在肝脏缺血再灌注损伤中对肝脏具有明显的保护作用。在肝脏移植物获取前,提高供肝内热休克蛋白含量,将明显减轻移植肝脏缺血再灌注损伤。目的:本实验采用心脏停搏供体大鼠原位肝移植模型,采用肝脏缺血预处理诱导热休克蛋白,观察热休克蛋白70对心脏停搏后不同时间的供肝缺血再灌注损伤的影响,为临床合理有效地利用心脏停搏供肝提供理论依据。方法:Wistar大鼠76只,实验首先分2大组,即IP组(预处理组)和C组(对照组),每组38只,IP组(预处理组)大<WP=60>鼠,开腹后离断肝周围韧带,消除肝脏的侧枝循环,用Pringle’s法阻断肝门15分钟后,撤夹恢复血供,关腹。C组(对照组)大鼠,只给予游离肝门,然后关腹。分别于术后6小时、24小时、48小时,每组每次取出2只开腹快速取肝组织液氮保存,待检测HSP70。48小时后,将剩余每组32只,以缺血预处理与否,以及供肝获取前经历的供体心脏停搏时间45分钟或60分钟分为4组。分别为非预处理的45分钟组(N-45)及60分钟组(N-60)、预处理的45分钟组(tN-45)及60分钟组(tN-60)。而后分别作为供体进行大鼠原位肝移植,N-45组和N-60组每组各16只,tN-45组和tN-60组每组各16只。动物模型建立参照Kamada法及Calne二袖套法,并略有改进。用4℃生理盐水20毫升(含肝素100U)持续灌注供肝至变白,切除供肝置于4℃平衡盐溶液中保存。1小时后行原位肝移植。各组8只肝移植大鼠于受体移植肝门脉复流后1h处死取材,采集血样检测肝功能,肝脏标本行光学显微镜检查。各组其余肝移植大鼠,N-45组、N-60组、tN-45组、tN-60组每组8只,用以观察存活情况,对于超过1周的肝移植大鼠,随机选取1-2只不予处理以观察长期存活时间,其余均于术后7天处死取材,观察肝脏病理学改变。用Western Blotting法检测肝组织中HSP70的表达,自动生<WP=61>化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平,肝组织行光镜检查。移植过程中记录供肝冷缺血时间,受体无肝期和受体手术时间。应用SAS 6.12统计分析系统,采用重复测量设计的方差分析、单因素方差分析、t检验和生存率分析(survival test)Log-Rank检验对全部数据进行统计处理,取α=0.05为差异有无显著性检验水准。结果:(1)IP组在6h仅有微量HSP70表达,至24、48h,其表达水平明显增强;而C组在24、48h几乎仍无表达。(2)四组动物之间供肝冷缺血时间、受体无肝期、受体手术时间比较差异无显著性(P>0.05)。(3)与非预处理组相比,预处理各组大鼠的1周存活率明显升高(P<0.05)。(4)与非预处理组相比,预处理各组大鼠门脉复流后1h的血清ALT和AST水平明显降低(P<0.05)。(5) 移植肝灌注后1h,tN-45和tN-60组肝小叶结构基本完好、无嗜酸性变、点状坏死或空泡变性等病理学改变,而N-45组出现部分肝细胞的嗜酸性变、点状坏死、空泡变性,N-60组肝细胞出现明显的嗜酸性变、浊肿变性、空泡变性和点状坏死、伴有汇管区炎细胞浸润。术后1周,tN-45组和tN-60组移植肝光学显微镜下肝小叶结构完好,汇管区有少量淋巴细胞浸润;而<WP=62>N-45组移植肝则出现了较多的肝细胞坏死和气球样变。结论:1.肝脏缺血预处理后,肝组织内HSP70的表达明显增强。2.HSP70可以显著提高心脏停搏供体肝移植的存活率,并能明显改善术后肝脏功能和减轻肝脏病理学改变。3.HSP70对心脏停搏供体肝移植的缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。