O-GlcNAc糖基化及最近发现的相关的6位带有磷酸基团的O-GlcNAc6P修饰是目前蛋白糖基化研究的热点之一。在O-GlcNAc的研究中,化学酶法糖标记（Chemoenzymatic glycan labeling）是近年来开发的有效研究方法。这种方法利用一种糖基转移酶（BGalT-Y289L）的特定底物特异性对O-GlcNAc结构中的GlcNAc进行糖链衍长,再通过引进的带有化学反应手柄的单糖衍生物进行下一步的点击化学反应,从而添加上检测标签比如荧光基团或亲和标签比如生物素等。BGalT-Y289L是一种牛来源的半乳糖基转移酶（GalT）的突变体,目前主要通过大肠杆菌重组表达、包涵体复性获得,未能实现可溶性表达是其应用的一大阻碍。另外,研究发现,其它一些GalT 比如Helicobacter pylori来源的β1-4GalT（Hp1,4GalT）也有作为化学酶法标记工具酶的潜力。本论文的目标之一是使用大肠杆菌重组表达出可溶的、有活性的Hp1,4GalT和BGalT-Y289L,同时探索可以识别GlcNAc-6P的GalT。为此,论文第二章合成了 GlcNAc-S-pNP、GlcNAc-6P 及其衍生物 6P-GlcNAc-S-pNP,作为 GalT 的受体底物。第三章,对优化后的BGalT-Y289L与Hp1-4GalT编码基因序列进行了人工合成,获得了一系列BGalT-Y289L和Hp1,4GalT表达载体。对于Hp1,4GalT,目的基因与麦芽糖结合蛋白编码基因进行融合,大肠杆菌表达后获得了可溶的、有活性的目的蛋白。对于BGalT-Y289L,我们创新性的使用来自Staphylococcus hyicus的脂肪酶前肽片段作为融合标签与其进行融合表达,获得了可溶的、有活性的目的蛋白。虽然研究结果表明两种GalT都不能以O-GlcNAc6P为底物,但两种GalT可溶性表达的实现为O-GlcNAc糖基化标记及相关糖链的合成提供了更易于获得的工具酶。论文第四章的研究内容涉及一种核苷酸糖合成方法的开发。核苷酸糖作为Leloir型糖基转移酶所必需的糖基供体,在糖链、糖蛋白、糖脂及糖修饰小分子酶促合成中必不可少。核苷酸糖对这些糖类化学物的合成、修饰、改造及其在医药等领域的应用具有重要价值。L-阿拉伯糖广泛存在于植物和微生物细胞结构中,是植物中第二丰富的戊糖。尿苷二磷酸阿拉伯糖（UDP-阿拉伯糖）是阿拉伯糖基转移酶的供体底物,是生物体中含L-阿拉伯糖的糖类化合物合成的必需前体。目前,已有一种化学及酶催化结合的方法制备UDP-阿拉伯糖,其特征是先通过化学法合成阿拉伯糖-1-磷酸,再通过拟南芥来源的UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP以化学合成的阿拉伯糖-1-磷酸为底物合成UDP-阿拉伯糖,此方法中化学合成的阿拉伯糖-1-磷酸为混合物,包括β-L-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸和-αL-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸,两者难以分离,而AtUSP只能利用β-L-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸为底物,所以此方法具有化学反应步骤多不经济不环保、酶反应效率低、先化学合成再酶反应耗时长等问题。为此,论文第四章,我们由微生物Paludisphaera borealis中筛选到一种具有阿拉伯糖激酶活性的单糖激酶PbAraK,实现了其重组表达,并对其单糖底物适应性、最适反应条件进行了探索。结果表明,PbAraK可以识别L-阿拉伯糖及L-核糖合成相应的糖-1-磷酸;研究还发现此酶和其他单糖激酶类似,具有金属离子依赖性,确定了其最适反应温度为45℃,最适pH为7.5-8.0。在此基础上,结合AtUSP（EC 2.7.7.64）和无机焦磷酸酶（EC 3.6.1.1）,建立了一锅三酶生物合成UDP-阿拉伯糖的方法。较化学合成阿拉伯糖-1-磷酸相比,PbArak酶法合成步骤简单、经济高效,适用于阿拉伯糖-1-磷酸及UDP-阿拉伯糖的规模化制备,具有潜在应用价值。