【摘 要】
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目的:本研究旨在探究atRAL能否诱导感光细胞发生铁死亡及其具体作用机制,并探究铁死亡在视网膜退化和感光细胞死亡中的具体作用。方法:首先,将atRAL与661W感光细胞共孵育,通过MTS法检测细胞的活力,并使用普通显微镜观察细胞形态变化;同时,分别使用荧光定量PCR仪检测铁死亡相关基因与铁离子代谢相关基因的变化水平;另外使用Western blotting技术检测铁死亡相关蛋白的变化水平;利用探针
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目的:本研究旨在探究atRAL能否诱导感光细胞发生铁死亡及其具体作用机制,并探究铁死亡在视网膜退化和感光细胞死亡中的具体作用。方法:首先,将atRAL与661W感光细胞共孵育,通过MTS法检测细胞的活力,并使用普通显微镜观察细胞形态变化;同时,分别使用荧光定量PCR仪检测铁死亡相关基因与铁离子代谢相关基因的变化水平;另外使用Western blotting技术检测铁死亡相关蛋白的变化水平;利用探针FeRhoNox-1检测细胞中Fe2+的变化;另外,使用脂质过氧化检测试剂盒与流式细胞仪检测细胞中的脂质过氧化水平;并通过透射电镜与线粒体探针Mitotracker Red CMXRos观察线粒体的损伤变化情况;以及使用GSH检测试剂盒检测细胞中GSH的变化水平。此外,通过加入外源性的GSH后,再利用MTS法检测atRAL处理661W感光细胞后的活力;并检测铁死亡相关基因和蛋白变化水平,以及通过探针H2DCFDA检测细胞中ROS水平;同样,使用铁死亡选择性抑制剂Fer-1和铁离子螯合剂DFO,进一步处理661W细胞后,通过LDH释放检测试剂盒和MTS法检测细胞中LDH的释放与细胞活力;并利用荧光定量PCR仪和Western blotting技术检测铁死亡相关基因和蛋白变化水平;并分别再次检测细胞中的脂质过氧化和ROS水平,同时利用探针FeRhoNox-1和ICP-MS技术检测胞内Fe2+和总铁离子的水平。之后,通过光照诱导Abca4-/-Rdh8-/-小鼠的神经视网膜退化的动物模型,进行体内实验验证。先利用病理组织学检查技术检查视网膜的病理变化;同时使用免疫荧光染色技术检测视网膜中脂质过氧化水平;以及使用GSH检测试剂盒检测视网膜中GSH的变化水平;并再次检测铁死亡相关蛋白表达水平。最后,通过铁死亡选择性抑制剂Fer-1对该动物模型进行治疗实验。同样,先检测视网膜病理变化,脂质过氧化水平,以及铁死亡相关蛋白表达水平。结果:本研究结果显示,atRAL通过诱导感光细胞发生铁死亡,进而促进视网膜退化。atRAL引发的感光细胞铁死亡是通过升高胞内Fe2+的水平,并激活铁死亡中脂质过氧化相关蛋白ACSL4,以及抑制system Xc-系统的活性和损伤线粒体引起的。过量的Fe2+,GSH的耗竭及损伤的线粒体,会导致大量ROS的产生,再加上激活的ACSL4蛋白,促进了感光细胞内的脂质过氧化水平,进而导致感光细胞发生铁死亡。此外,过载atRAL的感光细胞中,还激活了被广泛接受的铁死亡标志蛋白COX2。而外源性的加入GSH,铁螯合剂DFO,以及铁死亡选择性抑制剂Fer-1,都能够抑制atRAL诱导的感光细胞铁死亡发生。另外,显现出atRAL清除障碍的Abca4-/-Rdh8-/-小鼠作为干性AMD和STGD1的动物模型,我们观察到,光照诱导Abca4-/-Rdh8-/-小鼠的神经视网膜退化的过程中确实存在铁死亡。更重要的是,Abca4-/-Rdh8-/-小鼠在腹腔注射铁死亡选择性抑制剂Fer-1后,能够有效减轻光照诱导Abca4-/-Rdh8-/-小鼠中神经视网膜的退化及铁死亡的发生。结论:过载的atRAL引起地视网膜疾病中铁死亡是引起视网膜中感光细胞退化的重要死亡途径之一。铁死亡也参与了光照诱导Abca4-/-Rdh8-/-小鼠中神经视网膜的退化。而抑制铁死亡的发生,能够减轻光照诱导Abca4-/-Rdh8-/-小鼠中神经视网膜退化和感光细胞铁死亡。
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