精子从雄性生殖道释放时,并不具备受精能力,需要移行至雌性子宫或输卵管中孵育一段时间后,才能获得与卵细胞相结合形成受精卵的能力,导致发生功能转化的精子修饰过程称为“获能”。获能的动力来源主要是线粒体有氧氧化和糖酵解两种途径,但这两条途径的具体作用机制目前尚未明确。本研究首先运用蛋白组学的原理,采用i TRAQ技术分析猪精子获能前后的蛋白差异性。然后通过生物信息学技术对筛选得出的差异性蛋白进行功能注释、表达水平聚类分析、KEGG信号通路分析等,得到影响精子获能的关键蛋白。最后对关键蛋白进行生物信息学分析,并验证其对获能精子在抗氧化和糖代谢方面的作用。研究结果将为研究精子获能机制提供理论基础。具体方法和结果如下:试验1,基于i TRAQ技术的猪精子获能前后差异蛋白分析。以获能液孵育的性成熟公猪附睾头部的精子为试验组,不添加碳酸氢盐和Ca2+的未获能组为对照组。首先收集两组精子蛋白进行i TRAQ技术标记和测序,然后将差异蛋白数据在GO数据库进行搜库,最后对获能前后处理得到的差异性基因进行KEGG信号通路富集。结果表明:（1）猪精子在获能前后共检测到475种差异性蛋白,其中303种蛋白上调,172种蛋白下调。（2）这些差异蛋白是构成细胞膜（13.71%）、细胞器（10.66%）、细胞质（9.40%）等细胞组分的主要成分,主要参与氮化合物代谢、氧化还原、生物合成、有机循环化合物代谢、细胞芳香化合物代谢等生物过程和氧化还原酶活性、转运活性、底物特异性转运体活性、核酸结合、离子跨膜转运活性、辅因子结合等分子功能。（3）氧化磷酸化、胆固醇代谢、酮体的合成与降解、氨酰-t RNA生物合成、鞘脂信号通路、赖氨酸降解为精子获能的主要信号通路。试验2,猪精子PFK基因的克隆与生物信息学分析。通过p UC57载体克隆猪精子PFK基因并进行生物信息学分析。结果表明,PFK共含有782个氨基酸,蛋白质理论大小为83.819 ku,理论等电点为6.96,为酸性亲水蛋白质,分子式为C3674H5897N1051O1109S40。此外,PFK基因含有2个N-糖基化修饰位点,14个O-糖基化位点,35个磷酸化位点,可促进精子表面发生修饰;存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,能够参与己糖代谢和单糖代谢。试验3,PFK对获能精子抗氧化作用的影响。将PFK作用于获能精子2 h后,检测抗氧化物质的含量,并以SDHA为内参基因,分析抗氧化基因SOD、CAT、TR1与GPx4m RNA的表达量。结果表明:（1）当PFK的添加浓度为0.5μmol/L时,SOD、T-AOC酶活性相较于对照组差异极显著（P＜0.01）,5μmol/L PFK极显著提高CAT含量（P＜0.01）,并且1μmol/L PFK为抑制MDA产生的最优浓度（P＜0.01）。（2）当PFK的浓度超过0.5μmol/L时,SOD、TR1基因m RNA的表达量逐步下降（P＜0.01）;0.5-5μmol/L的PFK对于CAT基因的表达量并无明显影响（P＞0.05）,当仅有0.125μmol/L的PFK被添加时,获能精子CAT基因的m RNA的表达量极显著上调（P＜0.01）;GPx4基因的表达量呈现浓度依赖性,随PFK浓度的升高,其表达量逐步升高（P＜0.01）,并在1μmol/L达到最大值。试验4,PFK对获能精子糖代谢相关物质含量和基因表达的影响。以PFK孵育获能精子后,检测糖代谢相关物质的含量,并利用2-ΔΔCt法,以β-actin为内参基因,分析糖代谢相关基因的表达量。结果表明,当PFK浓度达到0.5μmol/L以上时,明显增加F1,6P2的含量（P＜0.05）,而0.125-0.5μmol/L的PFK对F1,6P2的含量无明显影响（P＞0.05）。随着PFK浓度的增加,HK的活性受到极显著的抑制（P＜0.01）,总胆固醇含量逐步升高（P＜0.05）。0.125μmol/L的PFK显著升高酪氨酸酶活性（P＜0.05）,当浓度超过0.25μmol/L时,酪氨酸酶活性极显著提高（P＜0.01）,并在5μmol/L时达到最优。糖代谢相关基因PFK、SLC2A3、MCT随PFK浓度的增加,表达量极显著升高（P＜0.01）;当PFK的添加浓度范围为0.5-5μmol/L时,HK-1的表达受到极显著的抑制（P＜0.01）。综上所述,本研究首先以猪精子获能前后差异性蛋白的筛选为切入点,推测PFK可能为潜在的关键蛋白。然后,通过生物信息学模拟了解PFK的理化性质和生物学特性。最后,通过其对获能精子抗氧化和糖代谢的影响分析,验证PFK能显著增强获能精子抗氧化和糖代谢的能力,为研究猪精子获能机制奠定分子基础。