地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.新鲜或干燥块根,生品具有清热凉血,养阴生津的作用[1]。传统地黄炮制方法有砂仁制、姜制、醋制、食盐水制、人乳制、童便制等不同辅料炮制,现代方法主要以清蒸、酒炖为主。炆地黄作为建昌帮特色炮制饮片之一,其辅料多样,独具地方特色,但现在存在应用程度不高、质量参差不齐等情况。故本研究首先对炆地黄炮制过程中的参数进行优化,得到最佳小试工艺,结合企业现有设备及生产条件,确定适用于企业放大化生产最佳炮制工艺。将炮制品与色度值相关联,找寻炆地黄炮制过程中成分与色泽之间的变化规律。后续比较不同炮制方法如生品、药典法（清蒸品、酒炖品）、九蒸九晒品及不同加热方式的炆法（传统糠炆制品、现代电炆制品）对浸出物含量及指标性成分的影响。为了进一步探讨炆地黄对滋阴药效的影响。首先通过网络药理学预测药物与疾病共有蛋白及相关通路,后续通过复制肾阴虚模型对比不同炮制品对滋阴药效的影响,并结合免疫印迹法和ELISA验证关键蛋白,从而找寻地黄不同炮制方法对滋阴药效的炮制机理,为临床应用提供科学依据。研究方法与结果:1建昌帮特色饮片炆地黄炮制工艺研究研究炆地黄炮制过程中的关键影响因素,以梓醇、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛、还原糖及外观性状为评价指标,利用层次分析法结合变异系数法计算各指标的权重,得出综合评分（OD）值。以加水量、闷润时间和蒸制时间为考察因素,结合Box-Behnken响应曲面法确定炆地黄的最佳炮制工艺参数。最终得出,在炮制工艺中各考察因素对工艺均有影响,其中蒸制时间影响较大,加水量次之。得出炆地黄实验小试最佳工艺为每100 g药材加7倍水炆制后,加入黄酒闷润5 h,上锅蒸制6 h为佳。经企业中试得到,加4倍水炆制后,加入黄酒闷润5 h,蒸制6 h为佳。2炆地黄饮片成分与色泽度相关性分析将生品及17批样品所含成分与色度值关联,找寻变化规律,完善炆地黄炮制过程的量化指标,以便更好地控制炮制程度。利用色差分析仪测定响应曲面法17个样品及生品的色泽度,通过SPSS、Prism等软件分析炆地黄成分与色度之间的相关性。表里关联结果为L与梓醇含量具有极显著正相关,与5-羟甲基糠醛和还原糖的含量呈极显著负相关;a与5-羟甲基糠醛的含量呈极显著正相关;b与梓醇含量呈极显著正相关,与5-羟甲基糠醛、还原糖的含量呈极显著负相关。实验发现生品颜色为棕灰色或棕黄色,炆制后变为乌黑色,当颜色介于棕灰色和棕黄色时,梓醇含量高,5-羟甲基糠醛和还原糖的含量低;当颜色介于棕黑色和乌黑色之间时,梓醇含量低,5-羟甲基糠醛和还原糖的含量高;当成品颜色为乌黑色时,5-羟甲基糠醛和还原糖的含量最高。3不同炮制方法对地黄浸出物及指标性成分的影响对比不同炮制方法,如生品、药典法（清蒸品、酒炖品）、九蒸九晒品及不同加热方式的炆法（传统糠炆制品、现代电炆制品）对浸出物及含量的差异性研究。采用药典冷浸法测定浸出物含量,高效液相色谱法和紫外分光光度计测定所含6种指标性成分的含量。最终发现,浸出物含量以酒炖品含量最高,九蒸九晒品含量最低。梓醇、地黄苷D、毛蕊花糖苷经过炮制后均呈现不同程度的下降,其中九蒸九晒品下降最为显著,各加热炮制品所含异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛和还原糖含量较生品呈不同程度的上升。表明不同炮制方法对地黄成分含量有一定影响,具体成分转化机制还有待进一步研究。4地黄不同炮制品对滋阴药效研究首先通过网络药理学相关数据库,发现熟地黄30种已知活性成分,可能与肾阴虚疾病密切相关,构建PPI网络,找到交集关键靶点,排名靠前有VEGFA,IL-Iβ,EGFR,SRC,CTNNB1,CASP3等。通过GO和KEGG通路富集分析,发现熟地黄治疗肾阴虚可能与雌激素信号通路、HIF-1信号通路等有关。后续通过复制肾阴虚模型,对比地黄不同炮制方法对滋阴作用的影响。在一般体征中,与空白组对比,模型组的大鼠逐渐出现体重下降,肛温上升,毛发无光泽、抓取易脱落,饮水量、饮食量增加,尿多且黄,大便干,易怒躁动,拱背,不易抓取等的表现。与模型组对比,各给药组均有缓解。在脏器指数方面,与空白组比较,模型组大鼠胸腺指数显著降低（P＜0.01）;与模型组对比,除阳性药组及现代电炆制组,其他各炮制组的胸腺指数显著升高（P＜0.01）。在内分泌系统方面,与空白组对比,模型组大鼠的T3、T4、c AMP、c AMP/c GMP比值、CORT指标含量均明显升高,c GMP含量显著降低（P＜0.01）;与模型组对比,阳性药、生品及各炮制组T3、c AMP、c AMP/c GMP比值、CORT含量均显著降低,c GMP呈现升高趋势（P＜0.05或P＜0.01）,其中四碘甲状腺原氨酸T4除生品组无统计学意义外,其余炮制组均有显著性差异（P＜0.01）,各炮制组间无显著性差异。在免疫系统方面,与空白组对比,模型组大鼠IL-1β显著升高,给药后均呈不同程度的下降,以药典法酒炖组作用最为显著。结论:工艺优化及色度关联:通过多指标结合响应曲面法优化炆地黄炮制工艺,简单可行,结果可靠,为后续开展炆地黄质量控制和企业规模化生产提供依据。同时,采用色差仪进行色度值测定,科学判断炮制终点及质量,为进一步深入研究地黄炮制终点奠定了基础,为炆地黄饮片在炮制过程中质量监控提供数据支持,更好地有利于炆地黄规范性发展。化学成分:不同炮制方法使地黄成分含量变化不同。环烯醚萜苷类成分包括梓醇、地黄苷D等。其中梓醇具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用,地黄苷D具有抑制神经炎症发挥抗抑郁作用[2],两种成分均以生品含量最高,对比加热处理后的炮制品以酒炖品和清蒸品两种成分含量较高,九蒸九晒品含量最低。查阅文献发现,环烯醚萜苷类成分以益母草苷为基本骨架,高温加热后含量大幅降低,与所含糖基数目有关。梓醇为单糖苷,热稳定性较差,加热后含量下降显著,地黄苷D属于三糖苷,性质稳定,加热后下降较少[3]。炆制品的环烯醚萜苷类含量下降明显,可能是由于炆制时间较长,导致有效成分大量降解。苯乙醇苷类成分有毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等,具有抗肿瘤、保肝、抗衰老等功效[4]。炮制后毛蕊花糖苷的含量显著下降,以生品含量最高,九蒸九晒品含量最低;异毛蕊花糖苷含量显著升高,以传统糠炆制品含量最高,其原因一方面可能与受热时间长有关,另一方面可能是对比九蒸九晒品辅料多样,更容易促进有效成分溶出。其毛蕊花糖苷下降,异毛蕊花糖苷含量相应增加,可能是由于二者为同分异构体,在加热过程中毛蕊花糖苷发生异构化转化为异毛蕊花糖苷有关[5]。5-羟甲基糠醛是美拉德产物,具有改善血液流变学和神经保护作用。炮制品以九蒸九晒品含量最高,传统糠炆制品次之,美拉德反应是发生在还原糖与游离氨基化合物之间的非酶促褐变反应[6],随着温度的升高反应速率大大加快,而多流程炮制（炆、蒸、晒）受热时间长,因此相比其他炮制方法含量较高。还原糖是地黄炮制后升高的标志性成分,各炮制品以传统糠炆制品含量最高,生品含量最低。还原糖在高温100℃时蔗糖酶启动,因此炮制后含量升高[6]。对比辅料,发现不同加热方式的炆法其还原糖的含量均高于九蒸九晒品。有研究发现九蒸九晒品在第7次蒸晒后还原糖的含量趋于下降[7],而不同加热方式炆法采用黄酒、陈皮和砂仁三种不同辅料,其辅料种类和用量可能与还原糖含量变化有一定关系。对比炮制流程,多流程炮制的还原糖含量均高于单一流程炮制,可能由于多流程（炆、蒸、晒）炮制地黄受热时间长所致。有研究表明,还原糖可能是滋阴补血的主要药效成分,传统糠炆制品含量最高,提示可能滋阴作用较好,为后续开展滋阴药效研究提供基础。滋阴药效:通过数据库挖掘,找到熟地黄30种活性成分的靶点蛋白292个,肾阴虚疾病靶点共932个,通过Venny结果发现药物成分与疾病共有靶点共62个,通过PPI互作网络得到关键蛋白如VEGFA、IL-1β、CASP3等,分子对接均具有较好结合能。后续通过动物实验发现,从胸腺指数角度分析,除阳性药组和现代电炆制组外,其他组别均使胸腺指数有显著回升态势。从内分泌系统的影响分析,各炮制组通过降低T3、T4、c AMP、c AMP/c GMP比值和CORT的含量,从而缓解肾阴虚的症状。综合比较发现加辅料炮制组效果优于不加辅料清蒸组,单一辅料黄酒炮制组效果优于多辅料炮制组,推测黄酒可能是发挥滋肾阴药效的重要辅料。IL-1β是通过网络药理学筛选得到,属于免疫系统,结果显示生品组、药典法清蒸组、药典法酒炖组、传统糠炆制组、现代电炆制组及九蒸九晒组均对肾阴虚症状有治疗作用,以酒炖组效果最优。Western blot技术测定各组肾脏VEGFA、CASP3蛋白表达,发现VEGFA蛋白表达水平以酒炖组和传统糠炆制组趋势下降明显,CASP3蛋白表达水平以九蒸九晒组和现代电炆制组趋势下降明显。各炮制品虽存在差异,但不具备显著性差异。综合考虑,在内分泌系统方面,以现代电炆制组和酒炖组为佳,在免疫系统方面以酒炖组为佳,在VEGFA、CASP3蛋白表达方面以不同加热方式炆制组为佳。目前研究结果显示,现代电炆制组效果在内分泌系统、免疫系统和蛋白表达方面与传统糠炆制组趋势有所不同,但无显著性差异。这也提示我们在后续进行炆制工业化生产中,可以考虑改进炆制方式,采用电炆进行加热炮制,以便炆制技术更加方便,更好的应用临床发挥药效。