研究背景与目的食道癌是全球常见的恶性肿瘤之一,在2018年,全世界约有572034名新发的食道癌病例,有508585名患者因食道癌而死亡。我国是食道癌发病率与死亡率最高的国家之一,年新发病例24.6万例,死亡病例18.8万例,发病率居恶性肿瘤第六位,死亡率居恶性肿瘤的第四位。食道鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）作为我国食道癌最常见的类型,约占食道癌的90%。由于食道鳞状细胞癌的早期诊断比较困难、疾病进展较迅速,因而其预后较差。因此,进一步揭示在食道鳞状细胞癌的发生发展过程中的关键分子机制,可以提供食道鳞状细胞癌的新的治疗靶点和作为预测预后的生物标志物。长链非编码 RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）和微小 RNA（microRNAs,miRNAs）是两类重要的调控RNA,这两类RNA已被证实在许多病理生理过程中扮演着重要的角色。大量证据显示,众多lncRNA在恶性肿瘤等多种疾病中失去正常调控。并且,这些失去正常调控的lncRNA可能在疾病中发挥重要作用。就恶性肿瘤而言,业已揭示lncRNA能够调控恶性肿瘤细胞的生长、细胞周期、凋亡、侵袭、迁移、衰老、耐药等诸多方面。lncRNA发挥作用的机纷繁复杂。lncRNA能与蛋白、信使RNA、微小RNA或DNA直接结合,并进一步调控与它相互作用的分子的位置、表达、功能。与lncRNA一样,许多miRNA也同样被揭示在许多疾病中调控紊乱并发挥重要作用。且已有很多研究表明,miRNA是lncRNA发挥作用的一个重要环节,lncRNA可通过几种方式对miRNA进行调节。miRNA通过与目标mRNA的3’非翻译区（3’-untranslated regions,3’UTRs）结合而负性调控目标基因的表达,并进一步导致目标mRNA的翻译受到抑制和/或促进目标mRNA的降解。长链非编码RNA LincIN（位于ITGB1和NRP1基因间的长链非编码RNA）,近期被发现在人类乳腺肿瘤细胞中过表达,并与乳腺癌患者较差的预后相关。此外,LincIN也被揭示能够通过与核因子90（nuclear factor 90,NF90）结合而促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。然而,LincIN在食道鳞状细胞癌中的表达、生物学效应和机制仍然未知。因此,本研究拟探讨LincIN在食道鳞状细胞癌中的表达情况、其功能及作用机制。研究内容与方法1.探讨食道鳞状细胞癌中LincIN的表达情况及与预后的关系使用qRT-PCR检测56对食道鳞状细胞癌及相邻的癌旁组织中LincIN的表达水平,以及永生化正常食道上皮细胞系Het-1A及食道鳞状细胞癌细胞系TE-1、KYSE150和Eca-109中的LincIN表达水平,分别采用Wilcoxon符号秩检验,以及单因素方差分析（one-way ANOVA）联合Dunnett’s多重比较检验比较LincIN在组织中以及在细胞株中的表达差异;同时对56例食道鳞状细胞癌患者的LincIN的表达水平与临床病理特征及总生存进行分析,利用皮尔逊卡方检验（Pearson chi-square test）寻找LincIN表达水平与食道鳞状细胞癌患者临床病理特征的相关性;并使用 Kaplan-Meier 生存分析（Kaplan-Meier survival analysis）联合时序检验（Log-rank test）,分析56例食道鳞状细胞癌患者的LincIN表达水平与总生存间的关系。2.探讨LincIN的生物学功能我们通过稳定转染LincIN过表达质粒和对照质粒,建立LincIN稳定过表达和对照TE-1细胞株,以及通过稳定转染两个独立的LincIN特异性shRNAs建立LincIN稳定敲除和对照Eca-109细胞株;随后通过CCK-8实验、EdU实验、Transwell迁移和侵袭实验检测这些细胞株的生长、迁移和侵袭能力;使用Student’s t检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）联合Dunnett’s多重比较检验（Dunnett’s multiple comparison test）比较实验组和对照组的结果。3.探讨LincIN上调表达对下游miR-7的影响构建LincIN稳定过表达的TE-1细胞株和对照的TE-1细胞株、LincIN稳定敲除的Eca-109细胞株和对照的Eca-109细胞株。使用RNA免疫沉淀实验联合qRT-PCR,检测中LincIN与NF90的结合情况、NF90与pri-miR-7的结合情况,使用qRT-PCR检测pri-miR-7的表达水平和miR-7的表达水平,使用Student’s t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）联合Dunnett’s多重比较检验对结果进行统计分析。同时,我们利用qRT-PCR检测56对食道鳞状细胞癌组织及邻近的癌旁组织中miR-7的表达水平,并采用Wilcoxon符号秩检验进行统计分析,随后,采用Pearson相关系数分析探寻56对食道鳞状细胞癌组织中miR-7的表达水平与LincIN的表达水平间的关系。4.探讨miR-7下调对下游HOXB13分子的影响构建LincIN稳定过表达的TE-1细胞株、共转染LincIN过表达质粒和miR-7 mimics的TE-1细胞株和对照的TE-1细胞株,以及LincIN稳定敲除的Eca-109细胞株和对照的Eca-109细胞株。在这些细胞株中,使用荧光素酶报告实验检测HOXB13 3’UTR的活性,使用qRT-PCR检测HOXB13 mRNA的表达水平,使用Western blot检测HOXB13蛋白的表达水平。使用单因素方差分析联合Dunnett’s多重比较检验对实验结果进行分析。5.探讨miR-7过表达或HOXB13敲除对LincIN功能的影响首先通过Western blot实验,检测miR-7和LincIN共同稳定过表达的食道鳞状细胞癌TE-1细胞株、HOXB13稳定敲除及LincIN稳定过表达食道鳞状细胞癌TE-1细胞株、LincIN稳定过表达食道鳞状细胞癌TE-1细胞株、对照组食道鳞状细胞癌TE-1细胞株中HOXB13蛋白的表达水平,其次,随后通过CCK-8实验、EdU实验、Transwell迁移和侵袭实验检测这些细胞株的生长、迁移和侵袭能力;使用单因素方差分析（one-way ANOVA）联合Dunnett’s多重比较检验（Dunnett’s multiple comparison test）对结果进行比较。结果1.食道鳞状细胞癌中LincIN表达增加,并与食道鳞状细胞癌患者预后不良相关使用qRT-PCR测定了 56对食道鳞状细胞癌组织及邻近的癌旁组织LincIN的表达。结果显示,相对于邻近的癌旁组织,食道鳞状细胞癌组织中LincIN的表达明显增加。通过对56例食道鳞状细胞癌病例中LincIN的表达水平与临床病理特征进行相关性分析,发现LincIN的表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期呈正相关。进一步对LincIN的表达水平与56例食道鳞状细胞癌患者的总生存进行分析,发现LincIN表达水平较高的食道鳞状细胞癌患者其总生存期较LincIN表达水平较低者的总生存期短。此外,通过qRT-PCR分析永生化正常食道上皮细胞系Het-1A及食道鳞状细胞癌细胞系TE-1、KYSE150和Eca-109中的LincIN表达水平,结果显示,食道鳞状细胞癌细胞系中LincIN的表达水平显著高于正常食道上皮细胞系中LincIN的表达水平。综上,这些结果提示,LincIN的表达水平在食道鳞状细胞癌组织和细胞系中增高,并与食道鳞状细胞癌患者临床分期和预后相关。2.LincIN过表达促进食道鳞状细胞癌细胞生长、迁移和侵袭通过稳定转染LincIN过表达质粒和对照质粒,建立LincIN稳定过表达和对照TE-1细胞株。CCK-8实验显示,LincIN过表达促进了食道鳞状细胞癌细胞的生长。EdU实验进一步验证了 LincIN过表达对食道鳞状细胞癌细胞生长的促进作用。Transwell迁移实验显示LincIN过表达促进了食道鳞状细胞癌细胞的迁移。Transwell侵袭实验显示LincIN过表达促进了食道鳞状细胞癌细胞的侵袭。上述结果提示,LincIN过表达促进了食道鳞状细胞癌细胞的生长、迁移和侵袭。3.敲除LincIN抑制食道鳞状细胞癌细胞的生长、迁移和侵袭通过稳定转染两个独立的LincIN特异性shRNAs建立LincIN稳定敲除和对照Eca-109细胞株。CCK-8实验显示,LincIN敲除抑制了食道鳞状细胞癌细胞的生长。EdU实验进一步验证了 LincIN敲除对食道鳞状细胞癌细胞生长的抑制作用。Transwell迁移实验显示LincIN敲除抑制了食道鳞状细胞癌细胞的迁移。Transwell侵袭实验显示LincIN敲除抑制了食道鳞状细胞癌细胞的侵袭。上述结果提示,LincIN敲除抑制了食道鳞状细胞癌细胞的生长、迁移和侵袭。4.LincIN促进了 NF90对miR-7生物学效应的抑制作用RNA免疫沉淀实验显示,LincIN在NF90抗体组中有特异性富集,提示LincIN与NF90两者间存在结合。免疫沉淀实验显示,LincIN过表达促进了 NF90与pri-miR-7的结合。免疫沉淀实验同样提示,LincIN敲除抑制了 NF90与pri-miR-7的结合。这些结果提示,LincIN促进了 NF90与pri-miR-7的结合。接着,使用qRT-PCR测定LincIN稳定过表达和对照的TE-1细胞株中pri-miR-7和mature miR-7的表达水平,结果显示,LincIN过表达导致了食道鳞状细胞癌细胞中pri-miR-7的聚积和mature miR-7的下调表达。同样使用qRT-PCR测定了LincIN稳定敲除和对照的Eca-109细胞株中pri-miR-7和mature miR-7的表达水平,结果显示,在食道鳞状细胞癌细胞中,LincIN敲除下调了 pri-miR-7的聚积并导致了 mature miR-7的上调表达。上述结果提示,LincIN促进了 NF90对miR-7生成的抑制作用,因而下调了 mature miR-7的表达水平。5.在食道鳞状细胞癌组织中miR-7表达下调,并与LincIN呈负相关我们对上述56对食道鳞状细胞癌组织及邻近的癌旁组织中的miR-7表达水平进行了测定。与LincIN的表达模式相反,相较于邻近的癌旁组织,miR-7在食道鳞状细胞癌组织中的表达水平显著减少。通过对这56对组织中miR-7的表达水平与LincIN的表达水平进行相关性分析,提示在食道鳞状细胞癌中,miR-7的表达水平与LincIN的表达水平呈负相关,有统计学意义（r=-0.4024,P=0.0021）。6.LincIN 通过抑制 miR-7 上调 HOXB13双荧光素酶报告实验显示,LincIN过表达显著上调了 HOXB13 3’UTR的活性,而当同时存在miR-7过表达时,这种上调作用被逆转。相反,LincIN敲除显著下调了 HOXB13 3’UTR的活性。qRT-PCR实验显示,LincIN过表达显著上调了 HOXB13的信使RNA的水平,当同时存在miR-7过表达时,这种上调作用被逆转。相反,LincIN敲除显著下调了 HOXB13的信使RNA（mRNA）的水平。Western blot实验显示,LincIN过表达显著上调了HOXB13蛋白表达水平,当同时存在miR-7过表达时,这种上调作用被逆转。相反,LincIN敲除显著下调了 HOXB13蛋白表达水平。上述结果提示,LincIN通过抑制miR-7上调HOXB13的表达。7.miR-7过表达或HOXB13敲除能够逆转LincIN促进食道鳞状细胞癌细胞生长、迁移、侵袭的作用我们在LincIN稳定过表达的TE-1细胞株中稳定过表达miR-7或敲除HOXB13。CCK-8实验显示,miR-7过表达或HOXB13敲除都能减缓LincIN促进食道鳞状细胞癌细胞生长的作用。EdU实验进一步证实,miR-7过表达或HOXB13敲除都能减缓LincIN的促生长作用。Transwell迁移实验显示,miR-7过表达或HOXB13敲除都能减缓LincIN促进食道鳞状细胞癌细胞迁移的作用。Transwell侵袭实验显示,miR-7过表达或HOXB13敲除都能减缓LincIN促进食道鳞状细胞癌细胞侵袭的作用。上述结果提示,miR-7过表达或HOXB13敲除都能减缓LincIN促进食道鳞状细胞癌细胞生长、迁移、侵袭的作用。结论本研究中,我们发现非长链编码RNA LincIN在食道鳞状细胞癌中高表达,并与食道鳞状细胞癌患者的临床分期和预后相关。LincIN通过与NF90相结合抑制miR-7的生成并上调HOXB13的表达,从而促进食道鳞状细胞癌细胞的生长、迁移和侵袭。我们的结果提示,LincIN可能可以作为食道鳞状细胞癌的一个预后生物标志物和治疗靶点。