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【研究背景】炎性肠病（IBD）是一种包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）和克罗恩病（Crohn Disease,CD）在内的慢性非特异性肠道炎症。发生IBD后,患者常出现腹泻、腹痛、肠梗阻、粘液便,甚至是血便等临床症状。通常患者可使用5-氨基水杨酸（5-ASAs）、糖皮质激素、免疫调节剂和免疫抑制剂类的药物缓解IBD急性期的症状,但这些药物无法从根本上治疗IBD。伴随着病情的反复发作以及患者耐药性的产生,IBD的治疗也越来越困难。迁延不愈的IBD可能会导致肠纤维化,肠穿孔,结直肠癌等,严重影响患者生活质量。IBD的发病机制尚未明确,大多以高危致病因素对其进行解释,其中以遗传因素、免疫调节因素以及肠道菌群研究较为广泛。巨噬细胞是固有免疫的重要成员之一,在肠道免疫中发挥免疫监视、免疫信号传递以及吞噬病原菌的作用。近年来,伴随着对IBD免疫调节过程研究的深入,发现巨噬细胞在IBD的发病及疾病进展中扮演重要角色。QKI是一种调控RNA转录翻译及其稳定性的RNA结合蛋白。QKI可以影响人单核-巨噬细胞的分化过程,且实验室前期研究发现在小鼠脓毒症模型中,QKI分子可通过对芳香烃受体（Ahr）转录翻译的调控影响巨噬细胞的极化过程。因此,我们假设,QKI是否可以通过影响巨噬细胞的功能最终影响IBD的发生发展?【研究目的】本研究拟通过对IBD患者及DSS诱导的模型小鼠结肠巨噬细胞QKI分子表达水平的检测,分析QKI与IBD可能的相关性;建立DSS诱导的IBD模型,比较髓系条件敲除QKI小鼠与对照小鼠表型差异,明确髓系QKI分子缺失对IBD发生发展的影响,同时进一步探索关键分子机制并发现逆转表型的干预方法,丰富IBD的病理机制,为疾病治疗提供新的靶点。【研究方法】1.获取UC及CD患者结肠炎症部位及邻近正常组织切片,检测QKI在结肠巨噬细胞内的表达情况;流式细胞术检测IBD模型小鼠结肠巨噬细胞内QKI分子的表达量;2.构建髓系条件性敲除QKI小鼠(Lys M-Cre QKIfl/fl,KO)及对照小鼠(QKIfl/fl,WT)IBD模型（WT-DSS,KO-DSS）,每日监测小鼠体重,观察并收集小鼠粪便;3.通过灌胃WT-DSS和KO-DSS小鼠FITC标记的葡聚糖检测肠道通透性;处死后测量小鼠结肠长度并使用PAS染色、免疫印迹及免疫组化染色等方法检测造模小鼠结肠组织中肠道连接蛋白及相关分泌蛋白的表达量;4.流式细胞术检测WT-DSS及KO-DSS小鼠结肠组织中不同巨噬细胞及T细胞亚型的比例;5.使用免疫组化染色以及流式细胞术分别检测WT-DSS和KO-DSS小鼠结肠i NOS、ROS的表达水平,并使用Western blotting检测干涉QKI的RAW264.7细胞（sh QKI5）和对照细胞（sh NC）中氧化应激通路相关分子的表达情况;6.通过生物信息学分析、RNA-FISH和RIP等方法检测QKI与Keap1 m RNA的结合情况,并通过免疫荧光染色及核质分离后的免疫印迹实验检测KEAP1蛋白在sh NC和sh QKI5细胞胞浆胞核的分布表达情况;7.使用NRF2的激动剂BHA（5 m M）处理LPS刺激后的sh NC和sh QKI5细胞,免疫荧光及免疫印迹检测细胞NRF2表达水平及下游抗氧化应激相关蛋白m RNA的表达情况,同时荧光探针检测细胞ROS的表达量;使用BHA（20 mg/kg）干预WT-DSS及KO-DSS小鼠,观察小鼠IBD表型的变化;8.定植WT-DSS和KO-DSS小鼠粪便来源的肠道菌群至抗生素处理后的C57BL/6J小鼠,观察移植的肠道菌群在DSS诱导C57小鼠IBD模型过程中的作用;同时使用菌群与小鼠小肠上皮细胞MODE-K共培养,检测ROS的分泌及相关炎症因子、肠道连接蛋白和分泌蛋白m RNA的表达情况;9.通过16s测序,对WT-DSS和KO-DSS小鼠粪便来源的肠道菌群结构及比例进行检测;【研究结果】1.免疫荧光染色及流式细胞术检测结果显示IBD患者及IBD模型小鼠结肠巨噬细胞内QKI分子高表达;2.KO-DSS小鼠肠炎表型比对照小鼠WT-DSS更为严重,主要表现在体重持续下降,结肠缩短严重,粘液分泌显著减少,肠道连接蛋白表达量下调以及肠道通透性显著升高;3.相比于WT-DSS小鼠,KO-DSS小鼠结肠组织中总的巨噬细胞比例增加,其中M1型巨噬细胞显著增加,M2型降低,组织驻留型巨噬细胞未发现显著变化;Th1细胞比例稍有升高,Th17,Treg和Tc细胞的比例无显著差异;4.相比于WT-DSS小鼠,KO-DSS小鼠结肠组织i NOS和ROS表达较高;LPS刺激下,相比于sh NC细胞,sh QKI5细胞NOX2、KEAP1高表达,NRF2及NRF2调控的下游抗氧化应激相关分子低表达;5.QKI可与Keap1 m RNA特异性结合,QKI缺失时,Keap1 m RNA表达显著升高,出核比例增多,同时胞浆中的NRF2表达下调;6.体外实验,BHA可一定程度恢复LPS刺激后sh QKI5细胞中NRF2及NRF2调控下游抗氧化应激分子的表达,同时可降低sh QKI5细胞过高的ROS分泌;体内实验,BHA可一定程度上缓解KO-DSS组小鼠更严重的IBD表型;7.FMT实验发现单纯的KO-DSS小鼠粪便来源的肠道菌群转移可导致C57小鼠体重下降,同时该组再进行DSS造模时的肠炎表型也更为严重;8.相比于WT-DSS,KO-DSS粪便来源的肠道菌群可使MODE-K细胞ROS分泌增加,同时肠道连接蛋白和粘液蛋白m RNA表达下调;9.16s菌群测序结果显示,KO-DSS小鼠粪便来源的肠道菌群相较于WT-DSS小鼠粪便来源的肠道菌群结构发生较大改变;【结论】1.系统性的证实了巨噬细胞内QKI分子与IBD发生发展相关,QKI缺失,可使IBD模型小鼠疾病表型加重;2.关键分子机制研究发现QKI缺失可上调Keap1 m RNA表达进而使NRF2在胞浆的表达量下降,最终导致巨噬细胞抗氧化应激能力下调,使敲除小鼠表现出更为严重的结肠炎表型;同时,发现NRF2的激动剂BHA可一定程度上缓解KO-DSS组小鼠IBD表型,验证了NRF2-KEAP1通路在QKI调控巨噬细胞功能中的关键作用;3.QKI缺失可使IBD造模小鼠肠道菌群结构发生变化,异常的肠道菌群参与介导KO-DSS小鼠IBD的发生发展;