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输血是一种临床常见的治疗手段,然而当患者输入不相容的红细胞（RBC）或大量不相容的血浆时,会引发溶血性输血反应（HTRs）,包括迟发性溶血性输血反应与急性溶血性输血反应。急性溶血性输血反应（AHTRs）在输血开始后24小时内发生,一旦发生AHTR,就会产生大量的血红素（HEME）,当触珠蛋白和血红素加氧酶处理血红素的能力饱和后,机体不再能结合并清除血红素时,过多的血红素会导致器官的损害,如心、肺、脑、肠、胰、肝和肾等。因此,AHTR会严重威胁到患者的生命安全。在正常情况下,当血液流经肾小球时,原尿被滤过并可通过肾脏内的肾小管进行重吸收。肾小管可以重新吸收水、葡萄糖、氨基酸、尿素和电解质等。随后,产生终末尿进入膀胱后随之排出体外。如果肾小管上皮细胞（RTECs）受损,就不能产生有效的重吸收作用,导致异常的生理生命活动。发生AHTR时,高浓度的血红素流经肾脏,各种类型的细胞,包括巨噬细胞、血管内皮细胞、间充质细胞、足细胞和小管上皮细胞不断地与血红素接触,血红素诱导的毒性就会作用于这些细胞上。血红素可导致急性肾衰竭,抑制血红素加氧酶活性,还可促进RTECs的凋亡。然而血红素诱导RTECs损伤的机制尚不完全清楚。NLRP3炎症小体包含NLRP3、接头分子含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和效应分子胱天蛋白酶1（caspase-1）。NLRP3可通过多种活化途径激活。NLRP3炎症小体活化后,caspase-1前体切割成p20和p10蛋白,诱导IL-1β和IL-18的成熟和释放。NLRP3炎症小体的激活可导致焦亡,其特征是细胞膜上孔洞的形成。血红素可激活巨噬细胞中的NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体在肾炎和急性肾损伤的肾组织中有异常表达,RTECs在肾脏疾病中也可见NLRP3炎症小体的效应蛋白上调。目前还没有详细研究来阐明血红素如何激活RTECs中的NLRP3炎症小体。如果可以证明NLRP3信号在血红素诱导的RTECs损伤中发挥重要作用,那么抑制NLRP3炎症小体将可以控制溶血过程中的肾脏功能损伤。NLRP3抑制剂已被证明对治疗糖尿病、癌症和感染等多种类型疾病有效。一种名为MCC950的化合物可与NLRP3中NACHT结构域上的Walker B基序结合,阻断ATP水解,从而抑制NLRP3炎性小体的组装和激活;另一种化合物CY-09也被证明可以抑制NLRP3炎症小体的激活。本研究小组之前曾报道过一种名为66PR的小分子,它也是一种NLRP3抑制剂,能够抑制炎性肠病的进展。本课题研究以红细胞溶血产生的血红素为研究对象,探索NLRP3炎症小体在RTECs中的活化机制。使用小鼠原代RTECs和人肾小管上皮细胞系HK-2,进行了血红素对NLRP3炎症小体活化的体外研究,接着用溶血小鼠模型确认了RTECs中NLRP3炎症小体的活化过程,然后使用NLRP3基因敲除小鼠进行验证,最后使用对NLRP3炎症小体抑制剂,探索了基于NLRP3活化抑制,来控制急性溶血性输血反应肾脏功能损伤的可能性。主要研究结果如下:1.血红素直接损伤肾小管上皮细胞首先通过输注人血浆建立AHTR小鼠模型,利用血液常规检测、外周血涂片镜检、直接抗人球蛋白实验和肾脏功能生化分析检测等实验技术,确认了急性溶血小鼠模型的成功建立。肾脏组织切片及H＆E染色分析、免疫荧光实验和免疫印迹实验证实,溶血小鼠模型释放的血红素直接损伤了肾小管上皮细胞。体外HEME化学品作用于小鼠原代RTECs与人肾小管上皮HK-2细胞系,通过光镜与激光共聚焦显微镜的观察,确认了血红素可直接损伤肾小管上皮细胞。2.血红素通过活化NLRP3炎症小体损伤肾小管上皮细胞通过免疫印迹实验,确认了血红素处理小鼠原代RTECs与HK-2细胞后,可以引起肾小管上皮细胞种NLRP3炎症小体活化。利用扫描电镜与免疫荧光分析,证实了血红素可导致肾小管上皮细胞发生焦亡。借助小鼠溶血模型,通过免疫印迹和免疫荧光分析,观察到发生溶血反应小鼠的肾小管上皮细胞中的NLRP3炎症小体被活化,并且发生了细胞焦亡。3.明确了血红素活化肾小管上皮细胞中NLRP3炎症小体的途径为进一步研究血红素活化肾小管上皮细胞中NLRP3炎症小体的途径,通过钾离子浓度检测、免疫印迹实验、流式细胞术和细胞活力分析等技术,确认血红素活化NLRP3炎症小体的主要途径,包括了钾离子外流、线粒体损伤和ROS水平增高三种途径。4.敲除小鼠NLRP3基因可抑制血红素损伤肾小管上皮细胞使用NLRP3基因敲除小鼠,建立了溶血性输血反应模型,通过生化检测、肾组织切片及H＆E染色和免疫荧光分析,确认了敲除小鼠NLRP3基因,可以抑制溶血小鼠的肾小管上皮损伤和肾脏功能障碍。接着通过免疫印记、扫描电镜观察和免疫荧光分析,证实了NLRP3基因敲除小鼠的原代RTECs受血红素损伤的程度降低。5.66PR可抑制血红素对肾小管上皮细胞中NLRP3炎症小体的活化使用NLRP3炎症小体抑制剂66PR处理小鼠原代肾小管上皮细胞,通过免疫印迹、光镜观察、细胞活力检测和免疫荧光分析,确认了66PR可以抑制血红素对肾小管上皮细胞中NLRP3炎性小体的活化,通过钾离子浓度分析和流式细胞术,明确了66PR抑制NLRP3炎症小体活化的作用途径为钾离子外流和ROS信号。6.66PR可缓解AHTR小鼠肾功能损伤考虑到66PR可以体外抑制血红素对肾小管上皮细胞中NLRP3炎症小体的活化,本课题探索了66PR保护溶血性输血反应模型小鼠的肾脏功能,通过生化分析、肾组织切片及H＆E染色、免疫荧光和生存分析,证实66PR可缓解AHTR小鼠的肾脏功能损伤。研究结论血红素体内、体外可通过激活NLRP3炎症小体来损伤RTECs;小鼠敲除NLRP3基因可减轻血红素对RTECs的损伤,缓解急性溶血输血反应所致的肾脏功能障碍。小分子化合物66PR可直接识别、结合NLRP3分子,抑制RTECs中的炎症小体活化,缓解血红素引起的肾脏功能损伤。本研究阐明了以NLRP3为中心的急性溶血性输血反应中肾小管上皮细胞损伤机制,对应对血红素的肾脏毒性有十分重要的意义,为AHTR的治疗干预提供了新思路。