【摘 要】
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胃癌（Gastric cancer,GC）是消化道常见的恶性肿瘤,每年因胃癌死亡的人数约占癌症死亡总人数的7.7%。尽管过去几十年对胃癌的诊断和治疗水平有较大提高,但由于缺乏早期诊断和积极治疗,胃癌的发病率和死亡率仍在增加。在我国,主要因人们的饮食习惯、遗传和感染等高危因素导致胃癌高发,再加上人们的重视程度不够,大多数患者确诊即为进展期、中晚期,预后较差,所以寻找新的肿瘤标志物刻不容缓。淋巴细胞衔
【基金项目】
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江苏省高校自然科学研究重大项目；
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胃癌（Gastric cancer,GC）是消化道常见的恶性肿瘤,每年因胃癌死亡的人数约占癌症死亡总人数的7.7%。尽管过去几十年对胃癌的诊断和治疗水平有较大提高,但由于缺乏早期诊断和积极治疗,胃癌的发病率和死亡率仍在增加。在我国,主要因人们的饮食习惯、遗传和感染等高危因素导致胃癌高发,再加上人们的重视程度不够,大多数患者确诊即为进展期、中晚期,预后较差,所以寻找新的肿瘤标志物刻不容缓。淋巴细胞衔接蛋白 LNK（Lymphocyte Adaptor Protein,LNK）,又称为 SH2B3,属于SH2B家族成员之一,该蛋白不具备酶的活性,其高表达于血管内皮和造血干细胞及其前体细胞中。LNK作为一种连接蛋白在血液系统中被广泛研究,普遍认为LNK是血液系统中的一种肿瘤抑制因子,其通过激活位于细胞表面的酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase,TK）,抑制造血系统恶性肿瘤的发生发展。然而,在实体肿瘤中,针对LNK的研究屈指可数,少量的研究认为,在高级别卵巢癌、黑素瘤及甲状腺癌中LNK作为促癌基因发挥作用,而这与LNK在血液系统中的作用大相径庭。因此,为了进一步阐明LNK在实体肿瘤中的作用机制,丰富其生物学功能,我们以胃癌作为研究对象,分析LNK在其中的表达水平及功能机制,为胃癌的个性化治疗提供思路和靶标。方法:1.运用生物信息学方法从TCGA数据库中初步分析LNK在胃癌中的表达,并利用其他数据集进一步验证生信分析的一致性。2.稳定过表达hLNK的胃癌细胞株的构建。将实验室前期制备的慢病毒质粒pCDH-hLNK、pCDH及其辅助质粒经293T细胞包装,制备相应的慢病毒并感染人胃癌细胞株AGS,经嘌呤霉素抗性筛选后,获得稳定过表达hLNK的人胃癌细胞株AGS-hLNK。通过观察GFP荧光强度及western blot方法验证AGS中hLNK的过表达水平。3.稳定敲减hLNK的胃癌细胞株的构建。将慢病毒质粒（pLKO-shRNA、pLKO-shLNK83、pLKO-shLNK84）与其对应的包装质粒共转染293T细胞,获得敲减hLNK的慢病毒。将上述慢病毒感染人胃癌细胞株SGC-7901,经嘌呤霉素筛选后,获得稳定敲减hLNK的胃癌细胞株:SGC-7901-shLNK83（7901-shLNK83）、SGC-7901-shLNK84（7901-shLNK84）,对照株 SGC-7901-control（7901-control）,western blot方法验证SGC-7901中hLNK的敲减水平,并明确最有效敲减hLNK的稳转细胞株。4.运用平板克隆形成实验、MTT方法分析hLNK过表达/敲减后对人胃癌细胞株增殖能力的影响;运用细胞划痕实验分析hLNK过表达/敲减后对人胃癌细胞株迁移能力的影响;运用transwell方法评价hLNK过表达/敲减后对人胃癌细胞株侵袭能力的影响。5.运用western blot方法分析hLNK过表达/敲减后,信号分子Jak2、Stat3、Stat5的激活水平,探究hLNK影响胃癌发生发展的主要机制。结果:1.通过对TCGA数据库中生物信息的挖掘,发现LNK在胃癌组织高表达,随后通过GSE54129和GSE29272数据集验证,结果一致。2.稳定过表达hLNK的胃癌细胞株AGS-hLNK构建成功。平板克隆、MTT实验结果表明,hLNK过表达后促进了细胞株AGS-hLNK的增殖;细胞划痕实验及transwell实验结果显示,过表达hLNK后,AGS-hLNK的迁移、侵袭能力均得到增强。提示,在胃癌细胞株中,LNK具有促进胃癌进展的作用。3.稳定敲减hLNK的胃癌细胞株7901-shLNK83构建成功。平板克隆及MTT实验结果显示,敲减LNK后,7901-shLNK83的增殖受到显著性抑制;细胞划痕实验结果显示,细胞的迁移能力未受显著影响。4.信号通路分子磷酸化水平的分析表明,过表达LNK后细胞株AGS-hLNK中p-Jak2、p-Stat3、p-Stat5水平获得显著上调,其中p-Stat3的水平得到极显著性增强。提示,LNK促胃癌进展的主要机制与Jak2-Stat3的激活相关。5.结论:LNK在胃癌中相对高表达,敲低LNK后抑制了胃癌细胞的增殖能力,过表达LNK后胃癌细胞的增殖、侵袭和转移能力均得到显著性提高。LNK促胃癌进展主要通过上调Jak2-Stat3信号通路的活化水平实现。
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