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目的:以玛咖为原料,通过分级醇沉法提取四种不同分子量的玛咖多糖组分。对比性研究玛咖多糖组分之间理化性质的差异,以及对CD4~+T细胞增殖和分泌细胞因子的影响,从而推进玛咖多糖的构效关系研究;以前述实验结果为基础,确定活性最高的玛咖多糖组分,将该组分进行荧光标记并探究玛咖多糖作用于CD4~+T细胞的方式。方法:(1)运用分级醇沉法从玛咖中提取出四种不同分子量的玛咖多糖组分(MCP1、MCP2、MCP3、MCP4),分别计算提取率,测定总糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量。运用尺寸排阻色谱法和高效液相色谱法测定玛咖多糖各组分的分子量和单糖组成,利用紫外分光光度计和红外光谱仪分别测定玛咖多糖的紫外光谱和傅立叶变换红外光谱,分析其化学结构。(2)免疫磁珠法分离小鼠脾脏的CD4~+T细胞,经玛咖多糖作用后,CFSE法检测CD4~+T细胞的增殖情况,ELISA法检测IFN-γ和IL-4的分泌水平。以上述实验为基础,选择活性最强的组分(MCP2)进行荧光标记。(3)MCP2与酪胺和硼氰化钠反应之后,再与FITC反应,从而将FITC结合于MCP2。将FITC标记后的MCP2用Sephadex G-200层析柱纯化,收集多糖和FITC含量均最高的洗脱液。将洗脱液冷冻干燥得到MCP2-Tyr-FITC并测定荧光标记效率。将MCP2和MCP2-Tyr-FITC分别加入CD4~+T细胞的培养体系,CCK-8法测定细胞的增殖情况,激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测MCP2-Tyr-FITC与CD4~+T细胞的作用方式。结果:(1)MCP1和MCP2具有相似的提取率、总糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量,而MCP2与MCP3、MCP4的提取率,糖醛酸含量和蛋白质含量存在明显差异。玛咖多糖组分(MCPs)自MCP1至MCP4的分子量呈现明显的由高到低的趋势。此外,MCP2的纯度高于MCP1、MCP3和MCP4。MCPs均由半乳糖醛酸(GalUA)、氨基半乳糖(GalN)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)等单糖组成,但是单糖组成的比例不完全相同,其中MCP2中GalN的含量明显高于其他三种组分。MCPs中仅存在微量蛋白质,并且其所含官能团的种类无明显差别。(2)MCPs均具有促进CD4~+T细胞增殖以及IFN-γ分泌的功能,最佳浓度为50μg/mL。此外,MCP2促进CD4~+T细胞增殖以及IFN-γ分泌的活性高于MCP1、MCP3和MCP4。然而MCPs对于IL-4的分泌无明显影响。(3)MCP2-Tyr-FITC的荧光标记效率为4.9%。与MCP2相比,浓度为50μg/mL的MCP2-Tyr-FITC对于CD4~+T细胞增殖的影响无明显差异。此外,实验结果表明MCP2-Tyr-FITC能够结合于CD4~+T细胞的膜表面。结论:(1)运用分级醇沉法成功得到了玛咖多糖的四种组分(MCPs)。MCPs的分子量和单糖组成均有所差异,其中MCP2的纯度最高,并且其GalN的含量明显高于其他三种组分。(2)MCPs均具有促进CD4~+T细胞增殖和IFN-γ分泌的功能(p<0.01),最佳浓度为50μg/mL,其中MCP2促进CD4~+T细胞增殖和IFN-γ分泌的功能明显强于其他三种组分。(3)MCP2-Tyr-FITC能够结合于CD4~+T细胞的膜表面。