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目的:甲基汞(Methylmercury,MeHg)是一种具有强神经毒性的有机汞化合物,对中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的损害尤为严重,但其神经毒性机制尚未阐明,并且目前尚无有效治疗甲基汞中毒的药物。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是机体适应性过程中发挥重要作用的转录调节因子,参与细胞生存、增殖、炎症、血管生成、葡萄糖代谢、红细胞生成等生理活动的调节。近年研究发现,HIF-1α信号通路在缺血、缺氧损伤及阿尔茨海默症等多种神经病变以及化学性损伤的发生发展中发挥重要作用。因而HIF-1α信号通路已经成为神经保护领域的研究重点。红景天苷(Salidroside,Sal)是从适应原样景天科植物红景天(Rhodiola rosea L)根茎中提取的重要生物活性成分之一,具有包括抗炎、抗衰老、神经保护等的药理学效应,已有研究发现红景天苷的神经保护效应与调节HIF-1α信号通路相关,然而其具体作用机制还未完全了解。因此,本实验以原代SD大鼠星形胶质细胞(Astrocytes,AST)为研究对象,研究Sal对MeHg神经毒性的拮抗作用及HIF-1α信号通路在其拮抗效应中的作用及其机制,探讨Sal发挥神经保护效应的可能机制,为Sal在临床中毒救治应用以及MeHg神经毒性的治疗和预防提供科学依据。方法:1.采用不同浓度MeHg(1、2.5、5、10μM,6 h)处理原代大鼠星形胶质细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞毒性,Hoechst 33342染色检测MeHg引起细胞凋亡的变化,Western blot法检测MeHg对细胞HIF-1α及其通路蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A表达的影响。建立SD大鼠急性MeHg损伤模型(2、4、6、8、10 mg/kg,0.5 h),Western blot法检测MeHg对大鼠脑组织HIF-1α及其通路蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A的表达差异。2.采用不同浓度Sal(5、10、20、40μM,24 h)预处理MeHg(5μM,6 h)损伤细胞,以MTT法评价细胞增殖活力,LDH法评价细胞毒性,Hoechst 33342染色评价细胞凋亡。3.运用Western blot方法检测不同浓度Sal(5、10、20、40μM,24 h)对细胞HIF-1α及其通路蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A以及异源二聚体蛋白HIF-1β表达的影响。运用Western blot方法检测空白对照组、MeHg(5μM,6 h)染毒组、Sal(20μM,24 h)干预MeHg染毒组细胞HIF-1α及其通路蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A以及异源二聚体蛋白HIF-1β的表达水平。采用siRNA敲减HIF-1α后,MTT法检测Sal保护MeHg损伤细胞活力的变化。4.RT-PCR法检测空白对照组、MeHg(5μM,6 h)染毒组、Sal(20μM,24h)干预MeHg染毒组细胞对HIF-1αmRNA水平的影响。运用HIF-1α核转位抑制剂2MeOE2抑制HIF-1α后,Western blot方法检测HIF-1α蛋白表达变化,MTT法观察Sal细胞保护效应的变化。Western blot方法检测空白对照组、MeHg(5μM,6 h)染毒组、Sal(20μM,24 h)干预MeHg染毒组细胞PHD-2蛋白活性变化。5.运用紫外可见光谱图分析200-500 nm波长范围内Sal与MeHg混合物吸收峰对应的波长以及吸光度值的变化。结果:1.与空白对照组相比,MeHg处理以剂量依赖的方式降低细胞增殖活力,升高LDH漏出率,引起细胞凋亡;5μM MeHg处理星形胶质细胞6 h,细胞增殖活力下降了44%(P<0.01),LDH漏出率升高了37%(P<0.01),引起细胞核固缩,呈碎块状致密浓染;Western blot结果显示,5μM MeHg处理细胞6 h引起HIF-1α蛋白表达降低51%(P<0.05),GLUT-1、EPO、VEGF-A蛋白的表达分别降低46%、31%、41%(P<0.05)。SD大鼠MeHg急性损伤模型中,脑组织HIF-1α及其下游蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A的表达呈下降趋势,当MeHg染毒剂量为8、10 mg/kg时表达显著降低(P<0.05)。2.与MeHg处理组相比,Sal干预引起细胞活力恢复,20μM红景天苷使细胞增殖活力升高30%(P<0.05),LDH漏出率明显降低58%(P<0.05),缓解了MeHg诱发的细胞凋亡。3.Sal(20、40μM,24 h)升高了细胞HIF-1α及其通路蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A的表达(P<0.05),但不同浓度Sal(5、10、20、40μM,24 h)对异源二聚体蛋白HIF-1β的表达无显著影响。干涉HIF-1α的表达后,Sal对细胞增殖的保护作用下降了14%(P<0.05)。4.与空白对照组相比,MeHg暴露以及Sal干预对星形胶质细胞的HIF-1αmRNA水平没有显著影响。HIF-1α核转位抑制剂2MeOE2抑制HIF-1α表达后,Sal恢复MeHg染毒细胞增殖活力的能力下降了22%(P<0.05)。Sal干预组的PHD-2活性与MeHg染毒组相比显著受抑,PHD-2活性降低了66%(P<0.01)。5.紫外可见光谱图提示红景天苷甲基汞混合物未发生化学键的变化,没有新物相的产生。结论:1.MeHg能引起星形胶质细胞活力下降、LDH漏出率增加、诱发凋亡。MeHg暴露引起体外培养星形胶质细胞和SD大鼠脑组织HIF-1α及其通路蛋白GLUT-1、EPO、VEGF-A的表达降低。2.Sal干预能够缓解MeHg引起的细胞活力降低、LDH漏出率升高和凋亡增加,并且改善MeHg引起的HIF-1α通路蛋白表达降低。3.Sal干预激活HIF-1α信号通路是其介导细胞保护效应的关键因素。4.HIF-1α核转位增加和阻滞PHD-2依赖的HIF-1α蛋白降解途径可能是Sal积累HIF-1α蛋白的重要环节。5.Sal拮抗MeHg损伤的细胞保护效应不是通过与MeHg发生配位反应实现的。