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研究背景:长久以来,转录起始复合物(PIC)的组装被认为是RNA聚合酶Ⅱ(也叫做PolⅡ或RNAP II)催化的真核生物转录调控的一个限速步骤。然而,近年来的研究表明转录过程在转录延伸水平存在着其他限速步骤——停滞在靠近启动子区域下游的Pol II的释放。PolⅡ的停滞需要多种调控因子共同发挥作用,包括转录延伸抑制因子DSIF、NELF、TRIM28以及表观遗传调控因子多梳抑制复合物1(Polycomb Repressive Complexes 1,PRC1)等。然而,这些因子是如何被招募到靶基因上执行抑制功能以及它们之间是否存在相互作用尚待研究。此外,Gdown1是一个新发现的、具有调控转录延伸抑制功能的蛋白因子,其抑制转录的功能机制和相互作用的蛋白因子尚不清楚。立题依据:(1)果蝇DSIF的亚基Spt5与PRC1的亚基Pho(Pleiohomeotic)之间具有直接相互作用,然而哺乳动物的PRC1与DSIF是否具有同源的相互作用还未有报道;(2)用人类前列腺癌细胞PRC1的核心亚基Ring1B进行IP实验,质谱分析表明其相互作用的蛋白中有Spt5,但是没有进一步的实验证明该相互作用;(3)最近被归类为转录延伸因子的TRIM28,其与PRC1之间具有相互作用已被我们早期的实验结果证实。故本课题一方面初步探索Gdown1可能的功能机制,另一方面探索哺乳动物PRC1与转录延伸抑制因子以及转录延伸抑制因子彼此之间是否存在相互作用。研究方法:(1)Gdown1有多种可变剪切形式,我们采用Real-time PCR的方法检测人类细胞和小鼠的组织、细胞中Gdown1转录剪切体的表达形式;(2)使用慢病毒包装质粒系统构建和筛选可诱导的Gdown1过表达/knockdown的HEK293T稳转细胞系;(3)采用核质分离实验、荧光观察实验等进行内源Gdown1和外源Gdown1的亚细胞定位;(4)根据实验室现有材料,采用双分子荧光互补实验(BiFC)、GST pull-down等实验检测表观遗传调控因子PRC1的主要亚基Ring1B/Cbx2/Cbx7和转录延伸抑制因子Gdown1/TRIM28/DSIF之间的相互作用以及Gdown1/TRIM28/DSIF彼此之间的相互作用。实验结果:(1)人类293T细胞和HeLa细胞表达全长Gdown1的368 aa亚型,小鼠3T3/F9/R1细胞和小鼠多种组织同时表达Gdown1的262 aa亚型和全长366 aa亚型,但366 aa亚型的表达量比较显著;(2)我们成功构建了可诱导的Gdown1过表达细胞系,Gdown1的knockdown细胞系构建已取得初步结果;(3)内源Gdown1主要存在于细胞核,外源Gdown1-Venus-Flag的荧光信号主要存在于细胞质;(4)Gdown1与hSpt4具有相互作用,Gdown1自身具有相互作用,Ring1B与hSpt5存在直接相互作用,TRIM28与DSIF的两个亚基hSpt4和hSpt5都具有相互作用。研究意义:本课题对Gdown1功能的初步探索及构建的稳转细胞系为以后研究Gdown1抑制转录延伸的机制奠定了一定基础。我们的实验证据表明,在稳定PolⅡ暂停的这一过程中,各种转录延伸抑制相关因子之间并不是孤立作用的,它们彼此之间相互作用,形成一个复杂的整体来稳定停滞的PolⅡ。特别是PRC1与转录延伸抑制因子相互作用形成一个有机整体来调控转录延伸是研究转录抑制的一个亮点,这为研究转录延伸抑制机制提供了一个新方向。