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猪繁殖与呼吸综合征最早流行于美国,现在遍布全球,给全球的养殖业造成巨大损失,对该病的诊断与预防显得尤为重要。该病的诊断方法很多,主要分为抗原检测：PCR、实时荧光定量PCR;抗体检测：IFA、IPMA、SVN、EILSA。与其他方法做比较,ELISA方法更容易操作,用时短,敏感,适合用于进行流行病学调查和疫苗免疫效果的评价。接种疫苗是预防与控制该病的主要手段,目前用于预防PRRS的常用疫苗是弱毒苗和灭活苗。弱毒疫苗虽然能提供较好的免疫保护,但存在毒力返强的危险。灭活疫苗不仅需多次重复接种,而且效果不稳定,还经常导致免疫失败。目前迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。PRRSV ORF5基因翻译产生的GP5蛋白能诱导中和抗体的产生,在猪感染PRRSV后康复猪血清中的中和抗体主要作用GP5蛋白,因此GP5蛋白成为了PRRS新型疫苗和诊断试剂的较好靶蛋白。鉴于此,本课题研究了GP5蛋白的表达,针对GP5蛋白的单克隆抗体的制备,PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立,以及PRRSV核酸疫苗的研究。1.GP5蛋白在大肠杆菌中的高效表达由于全长ORF5基因在大肠杆菌中表达量低或不表达,根据ORF5的结构特点,设计一对引物扩增截取信号肽后的ORF5序列,并将其克隆到载体pGEX-KG中,构建与GST融合表达的原核表达质粒pGEX-KG-ORF5,在IPTG诱导下获得高效表达。表达的融合蛋白GST-GP5分子量为38kDa,主要以包涵体形式存在。2. PRRSV WUH3株GP5蛋白单克隆抗体的制备将原核表达的PRRSV GP5蛋白纯化后作为免疫原,免疫4周龄BALB/C雌性小鼠,经细胞融合,间接ELISA方法筛选,共获得4株抗GP5蛋白的单克隆抗体(4A11、3D10、1E9、1H11)。将4株杂交瘤细胞分别注射小鼠后,大量制备腹水。将构建的真核表达质粒PCAGGS-HA-SynORF5转染Hela细胞后,收集样品。经Western blotting和IFA验证表明只有4A11、1H11能与真核表达的GP5蛋白发生特异性反应。3. PRRSV GP5-ELISA诊断方法的建立用构建的原核表达质粒pGEX-KG-ORF5表达的融合蛋白GST-GP5作为检测PRRSV抗体的抗原。先包被GST单抗在加GST-GP5蛋白,以此来建立检测PRRSV抗体的方法。经过方阵滴定确定GST最佳稀释度为1：10000,GST-GP5蛋白的浓度为2μg/mL。本研究建立的PRRSV抗体的诊断方法具有良好的特异性和重复性,检测208份临床血清与PRRSV进口试剂盒IDEXX的总符合率为86.1%。4. PRRSV核酸疫苗的构建、免疫小鼠后的体液免疫和细胞免疫利用PCR和酶切的方法将SynORF5、APCH1插入真核表达质粒PCAGGS-HA中,构建了共表达GP5和APCH1蛋白的真核表达质粒PCAGGS-HA-APCH1-Syn-ORF5、只表达GP5蛋白的真核表达质粒PCAGGS-HA-SynORF5以及只表达APCH1蛋白的真核表达质粒PCAGGS-HA-APCH1通过Western blot证实各真核表达质粒在Hela细胞中均能正确表达目的蛋白。为了研究APCH1蛋白能否使GP5蛋白的免疫原性增强,将真核表达质粒PCAGGS-HA-APCHl-SynORF5、 PCAGGS-HA-Syn-OF5和PCAGGS-HA-APCH1以及空白载体PCAGGS-HA分别免疫BALB/c小鼠,进行免疫反应效果的评价,结果APCH1和GP5蛋白共表达的质粒PCAGGS-HA-APCH1-SynORF5所诱导的针对GP5蛋白的ELISA抗体显著高于单独表达GP5蛋白的PCAGGS-HA-SynORF5免疫组(P<0.05),但是所诱导中和抗体不显著高于单独表达GP5蛋白的PCAGGS-HA-SynORF5免疫组(P>0.05)。在第一次免疫后第6周,分离小鼠脾淋巴细胞,用灭活的PRRSV刺激后,用检测IFN-y水平的ELISA试剂盒检测IFN-y的表达水平,结果显示PCAGGS-HA-APCH1-SynORF5所诱导的IFN-y水平显著高于PCAGGS-HA-SynORF5所诱导的IFN-y水平(P<0.05),研究表明,APCH1蛋白能增强PRRSV核酸疫苗的体液免疫反应和细胞免疫反应。