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[目的]1.分析CD146基因在血液恶性肿瘤中的表达、临床特征及预后意义。2.研究CD146基因在正常造血系统中的作用。3.研究CD146基因在费城染色体阳性白血病中的作用及其机制。[方法]1.通过流式、实时定量PCR(RT-PCR)及免疫组化等多种方式检测CD146在不同血液恶性肿瘤(初诊)及健康捐赠者中的表达。2.利用本中心血液恶性肿瘤的RNA-seq数据集及在线平台GEO数据集(Genes Expression Omnibus,GEO),分析CD146在血液恶性肿瘤中的表达。3.系统收集2009年1月至2019年6月本中心收治的初诊且有RNA-seq数据的Ph+B-ALL患者的临床信息,并进行临床特征分析。按照CD146表达量分为高表达组及低表达组,系统性分析两组患者的临床特征及CD146的表达量对Ph+ B-ALL患者的无复发生存期(relapse-free survival,RFS)、无事件生存期(event-free survival,EFS)及总生存期(overall survival,OS)的影响。4.通过流式检测正常人外周血中造血干/祖细胞及成熟细胞表面CD146的表达。5.构建造血系统特异性敲除的CD146敲基因型小鼠,通过检测外周血血象、骨髓细胞免疫表型等研究CD146在正常造血系统中的作用。6.构建CD146敲基因型小鼠协同BCR/ABL1小鼠移植模型等研究CD146在费城染色体(Ph)阳性白血病中的作用。7.构建细胞系来源的异体移植肿瘤模型(CDX)研究CD146过表达在Ph阳性白血病中的作用。8.对Ph阳性细胞系进行沉默或过表达CD146基因,随后进行细胞增殖、凋亡、周期等实验,研究CD146在Ph 阳性细胞系中的作用。9.通过对本中心转录组数据及GEO数据集基因芯片数据进行分析,研究CD146影响的基因及通路。[结果]1.对本中心初诊血液恶性肿瘤标本的流式及免疫组化结果显示,CD146表达阳性的比例在费城染色体阳性急性B淋巴细胞白血病(Ph+B-ALL)患者及慢性髓细胞白血病急变期(CML-BC)患者较高。RT-PCR检测结果提示,在Ph+B-ALL患者中CD146mRNA的表达水平明显高于其他类型血液恶性肿瘤(P<0.05)及健康捐赠者(P<0.05),且在CML-BC的表达水平明显高于CML慢性期(CML-CP)(P=0.018),提示CD146在费城染色体阳性的白血病中表达较高,且与疾病进展相关。健康捐赠者造血干/祖细胞表面及成熟细胞表面CD146的表达很低,均<2%。2.本中心急性白血病RNA-seq数据集分析结果显示,CD146在ALL患者中的表达高于急性髓细胞白血病(AML)及混合表型急性白血病(MPAL)(P<0.0001)。在ALL中,CD146在Ph+B-ALL中的表达高于费城染色体阴性急性B淋巴细胞白血病(Ph-B-ALL)(P=0.04))、费城染色体样急性B淋巴细胞白血病(Ph-like B-ALL)(P=0.01)及急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)(P=0.02)。本中心CML的RNA-seq数据集分析结果显示,CD146的表达在急变期略高于慢性期,但差异无统计学意义(P>0.05)。GEO数据集的数据分析显示,CD146在成人ALL患者中表达较高,在Ph+B-ALL中的表达高于Ph-B-ALL(P=0.01)及T-ALL(P=0.03)。对儿童B-ALL数据集的分析显示,CD146在Ph+B-ALL中的表达高于Ph-B-ALL患者(P==0.0001),但与T-ALL相比无明显差异(P>0.05)。CML的GEO数据集基因芯片结果分析显示,CD146在CML-BC中的表达明显高于 CML-CP(P<0.0001)和 CML 加速期(CML-AP)(P=0.0029)。3.共收集到信息较完善的Ph+B-ALL患者87例,随访截止时间为2021年12月31日。在这部分患者中,初诊时的血小板计数在CD146高表达及低表达组之间存在差异(P=0.005),在性别、年龄、初诊时的白细胞计数、血红蛋白计数、骨髓原始细胞、融合基因、染色体异常、诱导治疗使用TKI药物种类及诱导化疗后的疾病状态等方面均无明显差异(P>0.05)。对CD146高表达组及低表达组进行预后分析发现,CD146高表达组的OS明显劣于低表达组(P=0.03),但RFS及EFS无明显差异(P>0.05)。对GEO数据集中有临床信息的77例Ph+ B-ALL患者按照CD146的表达分组,并进行OS分析,结果显示,CD146高表达组患者的OS明显劣于低表达组(P=0.04)。对数据集中同时具有初诊及复发的B-ALL进行CD146表达分析,结果显示,CD146的表达在疾病复发时明显高于初诊时(P=0.01)。4.CD146敲除基因型小鼠中骨髓中造血干细胞(LSK)比例高于对照组小鼠(P=0.01),多潜能祖细胞(MPP)比例高于对照小鼠(P=0.03),巨核-红系祖细胞(MEP)比例高于对照组小鼠(P=0.01)。两种基因型小鼠在成熟细胞的比例差异不大(P>0.05)。在B淋巴细胞发育中,两种基因型小鼠骨髓、脾脏及淋巴结中总B淋巴细胞比例没有明显差异(P>0.05)。CD146敲除基因型小鼠骨髓中祖B淋巴细胞(pro-B)的比例显著高于对照组小鼠(P=0.0018),未成熟B淋巴细胞(Immature-B)比例略低于对照组小鼠(P=0.04),而两种基因型小鼠在前B淋巴细胞(pre-B)及循环B淋巴细胞(recirc B)的比例差别不大(P>0.05)。CD146敲除基因型小鼠与对照组小鼠均未出现白血病的表现。5.CD146基因的敲除延缓了 BCR/ABL1致白血病的发病时间,延长了小鼠的生存时间(P<0.05)。协同P190后,两种基因型小鼠发病时均表现为肝、脾肿大,且CD146敲基因型小鼠发病时肝脏重量低于对照组小鼠(P=0.02)。两种基因型小鼠发病时的免疫表型显示,CD146敲基因型小鼠LSK细胞比例低于对照组小鼠(P=0.03);MPP细胞比例低于对照组小鼠(P=0.035);短期造血干细胞(ST-HSC)比例低于对照组小鼠(P=0.03)。造血祖细胞(LK)、粒-单核祖细胞(GMP)、共同髓系祖细胞(CMP)及巨核-红系祖细胞(MEP)的比例两组小鼠差异不大(P>0.05)。两组小鼠发病时的成熟细胞的分化阻滞不完全一致,异质性较强,多为混合表型。6.CDX实验结果显示,单独过表达CD146的小鼠未出现白血病的表现,而在BaF3细胞中同时过表达CD146和BCR/ABL1小鼠的生存时间明显短于单纯过表达BCR/ABL1组小鼠(P=0.0019)。体外增殖实验显示,BaF3细胞中同时过表达CD146和BCR/ABL1的细胞增殖能力明显强于单纯过表达BCR/ABL1细胞(P<0.0001)。7.体外实验的结果:细胞增殖实验的结果显示,沉默CD146基因抑制了 K562及SUP-B15细胞的增殖(P<0.05);过表达CD146基因促进了 MEG01细胞的增殖(P<0.05)。细胞凋亡的结果显示,沉默CD146基因使K562细胞对伊马替尼处理后的凋亡率较对照组升高(P=0.009);过表达CD146的MEG01细胞凋亡率下降(P=0.0001)。细胞周期的结果显示,沉默CD146的K562细胞G2M期比例升高(P=0.0007);过表达 CD146 的 MEG01 细胞 G2M 期比例下降(P=0.001)。8.对本中心87例Ph+B-ALL中CD146高表达组及低表达组转录组进行GO和KEGG分析的结果显示,与低表达组相比,上调的差异基因主要富集在造血干细胞发育、细胞增殖等,富集的通路主要有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞黏附分子(cell adhesion molecular,CAM)信号通路、转化生长因子-β(TGF-β)信号通路、Ras信号通路等。下调的差异基因主要富集在B淋巴细胞的分化及活化等,富集的通路有造血细胞谱系等。GSEA肿瘤特征的富集分析发现,主要富集的通路为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路、TGF-β信号通路、P53信号通路、IL-2-STAT5信号通路、WNT-β-CATENIN信号通路、KRAS信号通路等。对GEO数据集Ph+B-ALL中CD146高表达组及低表达组的基因芯片数据分析显示,上调的差异基因主要富集的通路有PI3K-Akt信号通路、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)受体相互作用通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、TNF信号通路等。[结论]1.CD146在多种白血病中均高表达,包括ALL和CML,其中以ALL的表达最高,尤其是Ph+B-ALL,且与预后密切相关;在CML进展过程中,CD146的表达显著增加。2.CD146在健康人正常造血干/祖细胞及成熟造血细胞表面表达量很低。3.造血系统特异性CD146敲除基因型小鼠中部分造血干/祖细胞(LSK、MPP、MEP)比例增加,成熟细胞的比例没有明显差异。4.CD146敲除延缓BCR/ABL1致白血病的发生,延长小鼠的生存时间;CD146过表达加速BCR/ABL1致白血病进程,缩短小鼠的生存时间。5.CD146表达沉默后,K562及SUP-B15细胞增殖活性受到抑制、增加了伊马替尼所致的细胞凋亡,K562细胞对内皮细胞粘附能力下降、G2M期细胞比例增加;过表达CD146的MEG01细胞增殖能力增强、细胞凋亡减少、G2M期细胞比例减少。