研究背景：随着近年来人们饮食结构的改变和不良生活方式增加,(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的发病率正逐步上升,是目前最常见的慢性肝病之一。目前我国普通人群的患病率为10%-16%,全球平均患病率约为10.24%,在肥胖人群中增加到57.5-74%,对于排除了其他肝病原因的无症状性转氨酶升高,约42-90%是由于NAFLD所引起。NAFLD是一类病理改变类似于酒精性肝病(ALD)但无过量饮酒史的以肝细胞大泡性脂肪变性和脂质蓄积为特征的病理综合症,包括单纯性脂肪肝(simple steatosis)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纤维化(hepatic fibrosis)和肝硬化(hepatic cirrhosis)几个连续的病理过程,部分患者甚至会进展至肝癌及肝功能衰竭等终末期肝病。现认为NAFLD是代谢综合征(metabolism syndrome, MS)在肝脏的表现,它与肥胖、2型糖尿病、高脂血症、高胰岛素血症、高血压病等密切相关,严重危害人类健康。NAFLD的发病率正在迅猛升高,已成为危害人类健康最常见的慢性肝脏疾病之一。然而其明确的发病机制尚不清楚,还停留在假说阶段。目前较公认的是1998年Day提出的“二次打击”学说。该学说认为初次打击主要指胰岛素抵抗(IR)和脂质代谢紊乱所导致的肝细胞脂质沉积,导致肝脏脂肪变性,既为进一步的脂质过氧化(LP)反应提供了反应基质,也使肝脏对各种损伤打击的易感性增高；二次打击主要指各种原因在此基础上所致的氧化应激(OS)与脂质过氧化(LP)损伤。1993年肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-a, TNF-α)被认为是一种由脂肪细胞分泌的脂肪因子,亦是脂肪细胞中最先鉴定出来的炎症因子。它在局部脂肪组织中的表达与肥胖程度有一定正相关,是介导肝细胞损伤的脂源性因子中最重要的一种,可参与肝脏炎症及纤维化进展。而近年来研究发现,脂肪因子TNF-α在诱导和加重IR有重要作用。研究发现,TNF-α除可作用于胰岛素信号转导系统,使胰岛素受体底物磷酸化受阻,直接引起IR参与“初次打击”外,还可诱导IL-1、IL-6等细胞因子的产生,共同参与肝损害和肝脏炎症反应,并通过脂质过氧化(LP)使细胞受损,为“二次打击”提供了反应基质。从而促使单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化演变。NAFLD的典型特征是肝脏脂肪积聚。而甘油三酯(TG)是NAFLD患者肝脏内蓄积的主要脂质。肝脏摄取的脂肪酸绝大多数由贮存于脂肪细胞的脂肪分解而来,但NAFLD患者的肝脏TG来源与正常人比较只有60%来自游离脂肪酸(Free fatty acids, FFAs),而25%来自肝脏自身合成的脂肪酸(DNL),15%来自饮食摄入。这提示NAFLD患者肝脏自身合成脂肪酸是增加的,且有数条通路参与肝脏脂质蓄积,其中外周来源的脂肪酸增多和DNL是NAFLD肝内脂肪蓄积的主要因素。TG在肝脏组织中的过多储积是NAFLD发生的先决条件。而肝脏TG的积聚是合成与转化失衡的结果,这提示我们在肝脏脂质积聚的过程中可能还存在着TG的分解代谢受限。长期以来,激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)被认为是脂肪分解主要限速酶,但随着HSL基因敲除小鼠的出现,人们开始猜测在脂肪细胞中还存在着其它甘油三酯水解酶。2004年Zimmermann等筛选人和鼠类基因和蛋白质数据库,寻找和已知脂肪酶具有同源性的蛋白,结果发现了脂肪组织甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase, ATGL),不久Jenkins等和Villena等亦同样发现了这种蛋白。Zimmermann等利用受转染的COS-7细胞证明了ATGL催化甘油三酯水解为甘油二酯,但不水解胆固醇或者视黄醇。ATGL是一种催化甘油三酯第一步水解的重要脂肪酶,而HSL则主要水解甘油二酯,因此ATGL和HSL是脂肪分解反应的共同限速酶。而至目前为止,我们了解到多种因素可调节ATGL。比较基因组学鉴定蛋白58(Comparative gene-identification-58, CGI-58)特异性活化ATGL,在脂肪细胞中可与ATGL共同作用把甘油三酯水解酶活性提高20倍,从而刺激脂肪的分解,这证明CGI-58对ATGL酶活性发挥着重要作用；过氧化物酶体增殖因子活化受体y(peroxisome proliferative activated receptor-y, PPAR-γ)属于PPAR家族,还包括和PPAR-α, PPAR-β。 PPAR-y可调节脂肪代谢的很多方面,包括游离脂肪酸氧化、脂蛋白代谢、脂肪细胞分化等,其可调节细胞内很多脂肪代谢相关蛋白的表达,包括HSL,脂蛋白脂酶(LPL),脂联素等。在一项体外实验中可发现,PPAR-γ可促进脂肪细胞ATGL的表达,并且有实验证明用PPAR-γ激动剂罗格列酮饲喂小鼠,其ATGL和HSL的mRNA和蛋白的表达都显著增加；最近一项实验检测到,在3T3-L1脂肪细胞中,TNF-α能明显降低ATGL mRNA的表达,并呈时间和剂量依赖,并且此项实验中同样检测到了胰岛素在对ATGL的基因表达调控上和TNF-α有类似作用。有研究指出,ATGL可表达于肝脏并通过增强甘油三酯水解活性而促进游离脂肪酸的释放和氧化,改善肝脏的脂质代谢,减轻脂肪肝。因此,ATG与NAFLD的内在联系是近年来广大学者研究的热点。目前,用于治疗NAFLD的药物主要涉及胰岛素增敏剂、抗氧化剂、肝细胞保护剂、减肥药、调脂药等方面,因高脂血症是NAFLD发生的重要血清学基础,故调脂药物在NAFLD的预防和治疗中的作用也引起了人们的关注。研究调脂药物对ATGL的基因调控作用可能为今后治疗NAFLD提供了新的思路。第一部分NAFLD大鼠血清ATGL酶活性及TNF-α水平的变化分析目的以高脂饲料建立非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型,检测在大鼠NAFLD发生发展的过程中血清脂肪组织甘油三酯脂酶(ATGL)酶活性与肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平的变化,以及ATGL与TNF-α的关系,从而更好地了解非酒精性脂肪肝病的发病机理。方法78只7周龄雄性SD大鼠(210-230g)随机分为正常对照组(15只)和NAFLD模型组(63只)。以高脂饲料喂养NAFLD模型组大鼠,普通饲料喂养正常对照组大鼠。25g/鼠/天,自由饮水,维持喂养12周。于12周末,将所有大鼠禁食不禁水12小时后,由内眦采血2m1,检测血清甘油三酯(Triglyceride,TG),总胆固醇(Total cholesterol, TC),谷丙转氨酶(Alanine transaminase, ALT),谷草转氨酶(Aspartate transaminase, AST)及空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)。同时用高度敏感的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,检测血清脂肪组织甘油三酯脂酶(ATGL)及肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平。以10%水合氯醛(0.5m1/100g)对大鼠行腹腔麻醉,处死正常对照组大鼠2只和NAFLD组3只,取肝脏行病理学检测。结果1.经高脂饲料持续性喂养12周后,发现NAFLD模型组大鼠出现肥胖,腹部脂肪增多,且血清TG、TC、FBG、ALT、AST较正常对照组明显升高(均p<0.05),病检时发现模型组大鼠肝脏增大、肝内脂质沉积并伴有肝组织大泡性脂肪变性及肝小叶内和汇管区炎症细胞浸润及不同程度的肝细胞坏死等脂肪肝特征性病理改变。该模型与人类肥胖和/或糖尿病、高脂血症所致NASH的病理学改变极其相似,故从血清学和病理学上证实造模成功；2.造模12周后,发现模型组大鼠血清TNF-α水平较对照组明显升高(p<0.05), ATGL酶浓度显著下降(p<0.05)；3.在大鼠NAFLD发生发展的过程中,血清TNF-α与ATGL呈高度负相关(r=0.956,p<0.01)。结论1.高脂饲料维持饲养12周后可成功构建NAFLD大鼠模型；2.在NAFLD大鼠模型中,TNF-α呈高水平状态,而ATGL酶活性降低,且两者间呈高度负相关,这提示在NAFLD的发生发展过程中TNF-α与ATGL可能发挥着重要作用。第二部分辛伐他汀和非诺贝特对NAFLD大鼠ATGL mRNA表达及酶活性的影响目的以高脂饲料建立非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型,观察辛伐他汀和非诺贝特对大鼠NAFLD的治疗效果及其对肝脏组织脂肪组织甘油三酯脂酶(ATGL) mRNA的表达、血清ATGL酶活性及肿瘤坏死因子-a (TNF-a)水平的影响。从而进一步完善NAFLD的发病机制及探索其治疗方法。方法78只7周龄雄性SD大鼠(210-230g)随机分为正常对照组(15只)和NAFLD模型组(63只)。以高脂饲料喂养NAFLD模型组大鼠,普通饲料喂养正常对照组大鼠。25g/鼠/天,自由饮水,维持喂养12周后,从血清学和病理学上证实造模成功后,将余下的模型组大鼠均分为4组：(1)NAFLD模型对照组15只,(2)辛伐他汀治疗组15只,(3)非诺贝特治疗组15只,(4)饮食治疗组15只。对大鼠行灌胃治疗,其中,给予辛伐他汀治疗组大鼠：辛伐他汀4mg-kg-1·d-1;给予非诺贝特治疗组大鼠：非诺贝特40mg-kg-1·d-1;给予饮食治疗组等量生理盐水。16周末,以10%水合氯醛(0.5mg/100g)麻醉所有大鼠,经下腔静脉放血处死所有动物,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)、空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。称取各组大鼠肝湿重,计算肝指数,并通过病理学检测观察各组大鼠肝脏病理变化。同时用高度敏感的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,检测血清脂肪组织甘油三酯脂酶(ATGL)及肿瘤坏死因子-a (TNF-a),另外,通过聚合酶链式扩增反应检测各组大鼠肝脏中脂肪组织甘油三酯脂酶(ATGL) mRNA的表达情况。结果1.经高脂饲料持续性喂养12周后,NAFLD模型组大鼠出现肥胖,腹部脂肪增多,高脂血症,肝功能异常,且肝脏增大、肝内脂质沉积并伴有肝组织大泡性脂肪变性及肝小叶内和汇管区炎症细胞浸润及不同程度的肝细胞坏死等脂肪肝特征性病理改变。空腹血糖呈升高趋势。该模型与人类肥胖和/或糖尿病、高脂血症所致NASH的病理学改变极其相似,故从血清学和病理学上证实造模成功；2.经辛伐他汀和非诺贝特灌胃治疗4周后,与NAFLD模型对照组相比,两药物治疗组TG, TC, FBG、ALT、AST、BUN、Scr明显下降(均p<0.05),肝脏体积减小,肝脏病理检测可见脂质沉积状态减轻,炎症细胞浸润减少；3.经4周灌胃治疗后,两药物组大鼠TNF-α水平较NAFLD模型对照组大鼠明显下降(均p<0.05),且两药物组大鼠肝脏ATGL mRNA表达上调及血清ATGL酶浓度显著增强(均p<0.01),而两药物组组间差异无统计学意义；4.饮食治疗组大鼠脱离高脂饮食4周后,血清TC、ALT较模型对照组大鼠明显下降(均p<0.01),但与两药物组相比仍存在差异(p<0.05),病理显示饮食治疗组大鼠肝脏脂质沉积情况虽较模型组有所好转,但仍有小泡性脂肪滴,伴少量炎细胞浸润和坏死肝细胞,而血清TNF-α水平及ATGL mRNA表达及酶活性较模型组无明显差异(均p>0.05)；5.在NAFLD发生发展的过程中,血清TNF-α与ATGL呈高度负相关(r=0.948,p<0.05)。结论1.在大鼠NAFLD的发生发展过程中,TNF-α呈高水平状态,可能通过下调ATGL mRNA表达进一步影响ATGL酶活性,促使甘油三酯的蓄积；2. NAFLD大鼠肝脏ATGL mRNA表达下降时,ATGL酶水解活性可能会同步减弱；3.辛伐他汀和非诺贝特均能有效治疗NAFLD大鼠,两药物治疗组大鼠肝脏ATGL mRNA表达和ATGL酶活性均得到上调和增强,这提示两药物可能通过对ATGL的介导,从而改善大鼠肝脏的脂质沉积。