多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)是红茶加工过程中的关键酶。在红茶的加工过程中,茶叶中的多酚类物质经PPO的酶促氧化,形成茶黄素、茶红素(Thearubigins, TRs)等红茶中的重要品质成分,从而对茶叶色、香、味等品质产生深远影响。茶黄素是红茶中的重要品质成分,具有多种保健功效与药理功能。红茶中茶黄素的含量低,以红茶为原料来开发制备茶黄素的价值不大。而以茶儿茶素为底物,利用生物技术进行体外生物合成茶黄素,具有重要的理论与实际意义。本论文拟筛选出能高效表达且能高效催化儿茶素合成茶黄素的多酚氧化酶基因,并克隆其全长基因,构建基因工程菌,使多酚氧化酶基因在大肠杆菌或酵母菌内高效表达,优化工程菌高效生产多酚氧化酶的培养条件。主要研究结果如下：1、PPO基因的克隆及其序列分析以丰水梨嫩叶为材料,提取基因组DNA,应用PCR的方法克隆得到丰水梨PPO基因,基因全长1782bp,没有内含子,编码的PPO属于亲水性蛋白质,无跨膜结构,含有593个氨基酸,分子量约为65.8KDa,理论等电点为8.4。PPO的N端含有一段由47个氨基酸组成的转运肽,而无信号肽,引导PPO定位于叶绿体内。去除转运肽的成熟PPO分子量为60.8KDa,理论等电点为6.69。应用NCBI数据库中的在线BLAST功能对丰水梨PPO基因比对,结果显示丰水梨PPO基因的核苷酸序列及其编码的对应氨基酸序列与日本砂梨的相似性均为为99%。去除该部分转运肽序列后,克隆得到去除转运肽的成熟PPO基因,其核苷酸列和氨基酸序列与日本砂梨的核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均达到99%以上。PPO中含有两个铜离子结合区,主要位于PPO二级结构中的α-螺旋区域中。2、PPO基因原核表达载体的构建、原核表达及其分析分别将克隆得到的前体PPO基因和成熟PPO基因克隆至原核表达载体(pET32a),构建了重组原核表达载体。将重组原核表达载体转化至表达菌株DE3感受态细胞,经IPTG诱导表达得到目的蛋白。不同温度条件进行原核诱导表达,目的蛋白在28℃条件下表达较好；积累量在诱导培养3-6h内较多,随着诱导时间的延长,蛋白积累量增加不明显,PPO活性研究发现,PPO活性为50U/(mL-min);体外氧化儿茶素实验表明,诱导蛋白能够氧化儿茶素生成茶黄素,产物中酯型茶黄素居多,由前体PPO氧化得到的产物和成熟PPO氧化得到的产物中酯型茶黄素的比例分别有98.8%和90%。3、PPO基因的真核表达载体的构建分别将克隆得到的前体PPO基因和成熟PPO基因克隆至真核表达载体(pPICZα-A),构建了重组真核表达载体。