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目的:建立适用于钙成像记录技术的Sprague-Dawley(SD)大鼠正常和缺血再灌注损伤肝细胞的急性分离方法,利用钙成像技术研究钙池调控钙离子通道(store-operated channels,SOCs)在SOCs激动剂(去甲肾上腺素、ATP和后叶加压素)诱导的正常和缺血再灌注损伤肝细胞钙振荡过程中的作用。观察SOCs抑制剂(粉防己碱、U73122、尼氟灭酸)对正常和缺血再灌注损伤肝细胞钙振荡频率的影响;以期探讨生理和病理条件下肝细胞钙振荡过程中SOCs的改变及药物影响。同时,探讨花生四烯酸(non-selective cation channels(NSCCs)激动剂)对正常肝细胞钙振荡频率的影响,以期了解NSCCs是否参与肝细胞钙振荡。方法:以SD大鼠为实验动物,通过门静脉插管循环灌流Ⅳ型胶原酶原位两步灌注法急性分离正常和缺血再灌注损伤肝细胞。使用Fluo-4-AM标记胞内钙离子,应用SOCs激动剂(去甲肾上腺素、ATP和后叶加压素)诱发肝细胞钙振荡,应用钙成像技术测定正常和缺血再灌注损伤肝细胞内钙振荡的特性。应用SOCs激动剂诱发正常和缺血再灌注损伤肝细胞产生钙振荡,分别加入SOCs抑制剂(粉防己碱、U73122和尼氟灭酸)观察其对钙振荡的影响。观察花生四烯酸(NSCCs激动剂)对正常肝细胞钙振荡频率的影响。结果:通过大鼠正常/缺血再灌注损伤肝细胞分离方法,获得的肝细胞纯度和成活率可达85%,适用于钙成像实验。SOCs激动剂去甲肾上腺素(100 nM),ATP(1.2μM)和后叶加压素(0.5 nM)能够诱发正常肝细胞产生钙振荡。然而,对缺血再灌注肝细胞的研究表明,上述激素诱发产生钙振荡所需的浓度比正常组低,分别为去甲肾上腺素(10 nM),ATP(0.6μM)和后叶加压素(0.1 nM)。SOCs抑制剂粉防己碱(100μM)、U73122(25μM)和尼氟灭酸(20μM)能够完全抑制由SOCs激动剂去甲肾上腺素、ATP、后叶加压素在正常/缺血再灌注损伤肝细胞内诱发的钙振荡,抑制作用起效时间短,且它们的抑制作用均为可逆性。粉防己碱对于正常/缺血再灌注损伤肝细胞钙振荡的频率均有抑制作用,且这种抑制作用呈现浓度依赖性。应用去甲肾上腺素(100 nM)诱发钙振荡的IC50分别为:31.754μM(正常肝细胞)、45.994μM(缺血再灌注肝细胞)。应用去甲肾上腺素(10nM)诱发钙振荡组的IC50为26.458μM(缺血再灌注肝细胞)。结论:本实验成功建立了适用于钙成像技术的SD大鼠正常和缺血再灌注损伤肝细胞的急性分离方法。SOCs激动剂后叶加压素、ATP、去甲肾上腺素可以诱导急性分离的正常/缺血再灌注肝细胞产生规律性钙振荡,并且这种规律性的钙振荡可能需要外钙通过SOCs内流来维持。花生四烯酸不激活急性分离肝细胞膜上的NSCCs,相反它会抑制钙振荡,提示NSCCs并不参与维持肝细胞的钙振荡。本实验发现缺血再灌注损伤会增加肝细胞产生钙振荡的敏感性,推测可能与肝脏缺血再灌注损伤诱发的SOCs特性改变有关。前人的实验提示粉防己碱(磷脂酶A2抑制剂)、U73122(磷脂酶C阻断剂)、尼氟灭酸(抑制花生四烯酸代谢)是SOCs非特异性抑制剂,本实验发现粉防己碱、U73122、尼氟灭酸对于钙内流的抑制作用,可能是因为它们均为SOCs通道的直接抑制剂。上述研究结果丰富了肝细胞钙振荡机制理论,并为寻找新的在缺血再灌注过程中保护供肝的药物、解决外科临床的实际难题提供了实验依据。