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良性阵发性位置性眩晕（benign paroxysmal positional vertigo,BPPV）是最常见的外周性眩晕疾病,在神经内科门急诊接诊的眩晕患者中占有很高的比例。原发性BPPV患者中绝大多数是围绝经期女性。雌激素水平下降是BPPV的独立危险因素,本病是椭圆囊耳石脱落并异位至半规管而导致临床眩晕发作,但耳石脱落的具体机制尚不清楚。在前期的研究中[1],我们应用大鼠去卵巢模型发现:雌二醇对内耳耳石数目和排列结构的维持具有重要的作用,电镜下去卵巢大鼠内耳椭圆囊耳石数目减少、排列松散,而补充雌二醇可以逆转上述耳石异常;而且雌二醇通过与ERα/β形成的异源二聚体结合参与耳石蛋白OC90的表达。因此,雌二醇可能通过雌激素受体的转录因子样作用调节内耳耳石蛋白OC90的表达参与BPPV的发生。然而耳石的产生维持是一个动态调节过程,受很多耳石调节蛋白的综合作用,雌二醇是否对耳石调节蛋白起调控作用目前还没有研究。PMCA2(plasma membrane Ca2+-ATPase isoform2,PMCA2)和Pendrin是两种主要的耳石调节蛋白,PMCA2表达于前庭囊斑毛细胞静纤毛顶端,可将毛细胞内的钙离子泵入耳石微环境,为耳石形成提供原料,而Pendrin表达于内耳膜迷路移行细胞胞膜,在调节耳石微环境PH方面发挥重要作用;另外,Atp2b2基因（表达产物为PMCA2）和Slc26a4基因（表达产物为Pendrin蛋白）突变小鼠均会出现耳石形态结构异常及与此相关的平衡障碍。因此,本课题在前期研究的基础上,应用大鼠去卵巢模型探究雌二醇对于耳石调节蛋白PMCA2、Pendrin蛋白表达的影响,并应用大鼠幼鼠内耳基底膜培养方法进一步探究雌二醇对PMCA2调控的方式,诣在扩展对雌二醇与BPPV关联的内在分子机制的认识,为BPPV预防、诊治提供理论支持。第一部分去卵巢大鼠内耳PMCA2、Pendrin蛋白表达水平研究目的:应用大鼠去卵巢模型研究血清雌二醇、孕酮水平变化对耳石调节蛋白PMCA2、Pendrin蛋白表达水平的影响。方法:（1）将25只3月龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机等分成五组,分别为双侧卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）后补充雌二醇组（E2组）、OVX术后补充孕酮组（P组）、OVX术后补充雌二醇和孕酮处理组（E2+P组）、OVX术后补充溶剂芝麻油处理组（Veh组）及假手术后补充溶剂芝麻油处理组（Sham组）。Sham组行假手术,其余四组行双侧卵巢切除术。术后分笼饲养,一个月后各组分别予雌二醇（E2组）、孕酮（P组）、雌二醇和孕酮（E2+P组）、溶剂芝麻油（Veh组和Sham组）颈部皮下注射,每日一次。连续药物处理一个月后（术后二月末）处死各组大鼠,取双侧耳泡;（2）分别于术前、注药前（术后一月末）和处死前（术后二个月末）留取各组大鼠尾尖血,应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组大鼠血清中雌二醇、孕酮水平;（3）用蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）方法检测各组大鼠耳泡总PMCA2蛋白、Pendrin蛋白表达情况;（4）实时定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测Atp2b2基因和内参基因Gapdh基因的m RNA转录水平。结果:（1）分别对五组大鼠术前、注药前、处死前血清雌二醇水平进行单因素方差分析,结果分别为（F=0.232,P=0.917）、（F=30.021,P<0.001）、（F=171.603,P<0.001）。术前五组大鼠血清雌二醇水平无显著差异;注药前E2组、P组、E2+P组、Veh组大鼠血清雌二醇水平分别为41.66±8.97 ng/L、37.96±5.74 ng/L、40.84±4.74 ng/L、37.60±8.16 ng/L,与Sham组（86.25±12.80ng/L）相比显著降低（P值均小于0.001）;处死前E2组、E2+P组大鼠血清雌二醇水平（78.03±5.87 ng/L、75.36±9.38 ng/L）与Sham组（79.27±8.07 ng/L）相比无显著差异（P=0.993,P=0.725）,而P组（9.15±2.30ng/L）、Veh组（11.80±2.03 ng/L）与Sham组相比差异显著（P值均小于0.001）;（2）术前各组孕酮水平无显著差异（F=0.484,P=0.747）;注药前E2组、P组、E2+P组、Veh组孕酮水平分别为13.05±3.36 pmol/L、13.11±2.95 pmol/L、14.42±2.97 pmol/L、12.39±2.59 pmol/L,较Sham组（40.98±1.95 pmol/L）显著下降（单因素方差分析F=98.173,P<0.001,应用Dunnett-t检验分别将各组与Sham组相比较,P值均小于0.001）;处死前各组进行方差分析结果（F=243.768,P<0.001）,其中P组（50.33±3.13pmol/L）、E2+P组（53.41±4.79 pmol/L）与Sham组（41.11±3.88 pmol/L）相比孕酮水平升高（P=0.001、P<0.001）,而Veh组（6.80±1.12 pmol/L）、E2组（8.28±2.04pmol/L）与Sham组相比孕酮水平显著下降（P值均小于0.001）;（3）各组大鼠内耳总PMCA2蛋白相对表达量及m RNA转录水平均存在统计学差异（F=5.480,P=0.004）、（F=71.486,P<0.001）;其中E2组、E2+P组、P组、Veh组PMCA2蛋白相对表达量分别为101.32±9.12%、94.28±9.85%、71.23±21.08%、77.28±11.20%,与Sham组（100.00±10.50%）相比较,结果分别为P=1.000、P=0.895、P=0.008、P=0.042;上述四组m RNA转录水平分别为103.93±4.25%、95.22±4.64%、47.89±6.83%、51.04±12.21%,与Sham组（100.14±5.82%）进行比较,结果分别为P=0.829、P=0.676、P<0.001、P<0.001;（4）各组大鼠内耳总Pendrin蛋白相对表达量无统计学意义,F=0.911,P=0.477。结论:雌二醇水平降低可导致大鼠内耳总PMCA2 m RNA及蛋白相对表达量下降,而这种变化可以通过补充雌二醇逆转,血清孕酮水平变化对大鼠内耳PMCA2表达无影响;而雌二醇、孕酮水平变化对大鼠内耳Pendrin蛋白表达无显著影响。第二部分雌二醇调控PMCA2的受体机制研究目的:在第一部分动物实验的基础上,利用组织培养方法进一步对雌二醇调控PMCA2表达的作用方式进行探究。方法:（1）取同窝3日龄SD大鼠幼鼠断头处死,显微镜下取双侧内耳基底膜,分DMSO组（对照组）、DMSO+E2组（雌二醇处理组）、Ful+E2组（雌激素受体拮抗剂Fulvestrant联合雌二醇处理组）、XCT+E2组（ERRα反向激动剂XCT790联合雌二醇处理组）四组进行组织培养。于培养24小时后开始分别予DMSO、DMSO和雌二醇、Fulvestrant和雌二醇、XCT790和雌二醇进行干预,每日一次,连续培养2日后应用q RT-PCR方法比较上述各组PMCA2 m RNA转录水平。（2）取同窝3日龄SD大鼠幼鼠内耳基底膜进行组织培养,取材与培养方法同（1）中所述,分为DMSO组（对照组）、DPN组（ERβ激动剂Diarylpropionitrile处理组）、XCT组（ERRα反向激动剂XCT790处理组）、PPT组（ERα激动剂PPT处理组）、Ful组（雌激素受体拮抗剂Fulvestrant处理组）、XCT+PPT组（XCT790联合PPT处理组）、XCT+DPN组（XCT790联合DPN处理组）,分别于培养24小时后分别按照分组名称所对应药物进行单独或联合干预,每日一次,连续培养2日后应用q RT-PCR比较各组PMCA2 m RNA转录水平;（3）取3日龄SD大鼠幼鼠内耳基底膜,运用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）方法验证Atp2b2基因上游是否存在可与雌激素受体特异性结合的雌激素反应原件（Estrogen Response Element,ERE）。结果:（1）四组SD大鼠幼鼠内耳基底膜PMCA2 m RNA转录水平存在差异（F=58.333,P<0.001）;与DMSO组（100.04±3.06%）相比,XCT+E2组（106.85±9.24%）、Ful+E2组（108.52±11.32%）PMCA2 m RNA转录水平无统计学差异（P=0.472、P=0.307）,而DMSO+E2组（163.35±8.49%）较DMSO组显著升高（P<0.001）;（2）七组SD大鼠幼鼠内耳基底膜PMCA2 m RNA转录水平存在差异（F=33.945、P<0.001）;与DMSO组相比,DPN组（133.96±6.92%）、PPT组（124.91±10.67%）PMCA2 m RNA转录水平显著升高（P值均小于0.001）;而XCT组（84.84±11.21%）、Ful组（85.29±8.34%）、XCT+PPT组（85.45±8.67%）、XCT+DPN组（84.41±4.23%）PMCA2 m RNA转录水平较DMSO组降低,差异均具有统计学意义（P值分别为0.006、0.008、0.008、0.005）;DPN组较XCT+DPN组PMCA2 m RNA转录水平显著升高（P<0.001）,PPT组较XCT+PPT组PMCA2 m RNA转录水平显著升高（P<0.001）;（3）Atp2b2基因（转录产物为PMCA2）上游存在可与ERα、ERβ结合的特异性核酸序列,即ERE序列。结论:ERα、ERβ、ERRα均在雌二醇调节大鼠内耳PMCA2表达过程中发挥作用;Atp2b2基因上游存在可与E2-ERs复合体结合介导雌激素效应的ERE序列。结合前期实验的结论,雌二醇可以通过经典的雌激素直接基因型信号通路参与耳石调节蛋白PMCA2的表达调控。ERRα可能在ERα、ERβ介导雌二醇调控Atp2b2基因转录及PMCA2蛋白表达的过程中起关键作用。血清雌二醇水平显著下降可能通过上述ER/ERR介导调节通路影响内耳PMCA2表达,使耳石钙代谢发生异常,导致耳石结构稳定性下降更易于脱落,从而引发BPPV,这可能是围绝经期女性易发BPPV的机制之一。