【摘 要】
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本实验室前期通过甲基化敏感扩增多态性技术,克隆了在铅胁迫反应中甲基化水平发生变化的NbWRKY22基因和NbEHD1基因。NbWRKY22是WRKY转录因子家族成员之一。WRKY转录因子是一种在植物基因组中广泛存在的分子,它与目标基因的启动子区域的W-box元件进行特异的连接,从而调节其基因的表达。目前对于NbWRKY22参与调控植物生长发育的功能未知。EHD1属EHD蛋白家族的成员,EHD家族的
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31660064、32060498）；
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本实验室前期通过甲基化敏感扩增多态性技术,克隆了在铅胁迫反应中甲基化水平发生变化的NbWRKY22基因和NbEHD1基因。NbWRKY22是WRKY转录因子家族成员之一。WRKY转录因子是一种在植物基因组中广泛存在的分子,它与目标基因的启动子区域的W-box元件进行特异的连接,从而调节其基因的表达。目前对于NbWRKY22参与调控植物生长发育的功能未知。EHD1属EHD蛋白家族的成员,EHD家族的蛋白具有保守的EH结构域,参与细胞内吞作用。但是对NbEHD1是否有互作蛋白参与调控植物生长发育过程尚不清楚。采用Lex A酵母双杂交技术对NbEHD1的互作蛋白进行了筛选;完成了NbWRKY22蛋白的亚细胞定位分析;通过遗传转化技术,获得部分NbWRKY22过表达和CRISPR/Cas 9转基因植株。实验得到的主要结果如下:（1）利用Lex A酵母双杂交系统筛选互作蛋白构建NbWRKY22和NbEHD1的诱饵载体,进行细胞毒性以及自激活的活性检测。结果显示,NbEHD1无细胞毒性、无自激活活性;利用Lex A酵母双杂交系统进一步筛选,本氏烟草c DNA文库中得到21个可能与NbEHD1互作的蛋白。（2）NbWRKY22蛋白亚细胞定位将YFP荧光蛋白与NbWRKY22蛋白融合,在烟草叶片中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察,证实NbWRKY22蛋白定位在细胞核中。（3）本氏烟草的遗传转化构建NbWRKY22的过表达和CRISPR/Cas 9载体,通过农杆菌介导和植物组织培养技术,培育NbWRKY22的转基因植物。通过PCR鉴定,获得NbWRKY22过表达及CRISPR/Cas 9转基因烟草。本研究获得了NbEHD1的互作蛋白、验证了NbWRKY22蛋白的细胞定位、获得部分NbWRKY22转基因植物,为后续研究NbWRKY22、NbEHD1在植物中的功能奠定了基础。
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