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研究背景胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,不同国家的胃癌发病率也是不完全相同的,但在发展中国家(尤其是中国)的胃癌患者明显多于其他国家。目前,对于胃癌的治疗仍然是以根治性切除术为主、以放化疗为辅的综合治疗方案。随着消化内镜技术和外科手术的快速发展,胃癌患者的生存率得到了很大的改善。然而,在中国胃癌的发病率依然居高不下,这很大程度是基因突变和表观遗传学改变的累积所造成的。此外,还有一部分原因是部分患者(尤其是进展期胃癌患者)在传统治疗方案下有效率比较低。因此,探索新的胃癌生物标志物是势在必行的。组蛋白赖氨酸甲基转移酶2D(KMT2D/MLL2)是表观遗传调控的关键分子,其主要负责催化H3K4(H3K4me1)的氨基甲基化。研究表明,KMT2D基因在某些癌症中表现为很高的突变频率。同时,KMT2D还作为多个基因的增强子,在多种信号通路(如P53,cAMP等)的表达调控中起着重要的作用。最重要的是,KMT2D还能有效地抑制淋巴瘤的发生和转移。此外,在结直肠癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中,KMT2D对于其肿瘤细胞的增殖分化也是必不可少的。事实上,既往研究表明,敲低KMT2D基因的表达水平可以抑制肿瘤细胞的增殖能力、增强其的化疗敏感性。综上所述,KMT2D有望成为胃癌诊断和治疗的新的生物学标志物。KMT2D已经被证明在很多癌症的发生发展中担任着重要角色,但其与胃癌的关系尚不清楚,有待进一步研究。本研究,首先进行分析KMT2D在胃癌中的表达水平,进而分析其与胃癌患者临床病理特征及预后的关系。此外,为了更好地理解KMT2D在胃癌发生发展中的作用机制,我们进一步研究分析了KMT2D对胃癌增殖、凋亡的影响,及其与PTEN/PI3K/AKT等信号通路中的关系。第一部分KMT2D在胃癌组织中的表达及临床意义目的:探索胃癌中KMT2D的表达水平与临床病理特征及预后的关系。方法:1、收集2008年1月到2011年1月行手术治疗的110例胃癌患者的组织标本,术后的组织标本经两名经验丰富的病理学家诊断。2、用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测110例胃癌患者的癌组织及癌旁正常癌组织的KMT2D的表达。3、通过免疫组织化学实验检测110例胃癌患者的癌组织及癌旁正常癌组织的KMT2D的表达。结果:1、KMT2D在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(30/40,75%,P<0.05);2、KMT2D的高表达与胃癌患者的肿瘤大小(P= 0.005)、TNM分期(P=0.004)、淋巴结浸润(P=0.006)及淋巴结转移(P<0.001)相关;3、免疫组织化学结果显示,KMT2D蛋白主要定位于细胞核,在胃癌组织中表达程度高;4、Kaplan-Meier分析表明,KMT2D高表达组患者的总生存时间(P= 0.025)和无瘤生存时间(P=0.005)较低表达组者显著缩短。结论:胃癌纠组织中KMT2D的表达显著高于癌旁正常组织,且KMT2D与胃癌患者的预后不良相关。因此,KMT2D有望成为胃癌的预后和诊断的关键标志物。第二部分KMT2D对胃癌细胞增殖能力的影响目的:研究KMT2D对胃癌细胞增殖能力的影响方法:1、通过Western blot技术检测五种胃癌细胞株(BCG823、SGC-7901、MKN45、MGC823、HGC-27)及正常胃上皮细胞(GES-1)中KMT2D的表达情况。2、通过慢病毒转染技术干扰SGC-7901及MKN45细胞中KMT2D的表达,培养一段时间后用嘌呤霉素筛选并鉴定KMT2D稳定低表达的细胞株;3、敲低KMT2D基因的表达后,通过CCK-8、平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验等体内及体外实验检测SGC-7901及MKN45细胞增殖能力的变化;4、敲低KMT2D基因的表达后,流式细胞技术检测SGC-7901及MKN45细胞的凋亡水平;5、敲低KMT2D基因的表达后,流式细胞技术检测SGC-7901及MKN45细胞的周期分布情况;6、敲低KMT2D基因的表达后,Transwell实验检测SGC-7901及MKN45细胞迁移的变化;7、敲低KMT2D基因的表达后,Western blotting检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达水平。结果:1、Western Wotting结果显示:KMT2D的表达水平在SGC-7901 及MKN45胃癌细胞株的表达相对较高。2、慢病毒转染SGC-7901及MKN45细胞后,Western blot结果显示胃癌细胞内的KMT2D表达明显下降(P<0.001)。3、敲低KMT2D基因的表达后,CCK-8、平板克隆形成实验及皮下成瘤实验结果一致显示:SGC-7901及MKN45细胞增殖受到显著抑制;4、敲低KMT2D基因的表达后,SGC-7901及MKN45细胞的凋亡水平均发生显著上升(P<0.01);5、敲低KMT2D基因的表达后,SGC-7901及MKN45细胞均被阻滞于G2/M期;6、敲低KMT2D基因的表达后,SGC-7901及MKN45细胞的侵袭、转移能力均未见统计学差异。7、敲低KMT2D基因的表达后,KMT2D通过PTEN/PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞的增殖。结论:下调KMT2D的表达可以抑制胃癌细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡,并将更多的胃癌细胞阻滞在G2/M期。综上所述,KMT2D可能是胃癌患者的一个重要的调控靶点。