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多囊肾病(polycystic kidney disease,PKD)是指双侧肾脏发生多个囊肿且进行性长大而导致肾脏结构和功能损害的一种单基因遗传性疾病。根据遗传方式的不同多囊肾可以分为两种：常染色体显性遗传性多囊肾病和常染色体隐性遗传性多囊肾病。在北美大约有500,000受累ADPKD的发病率为1/500-1000,ARPKD的发病率为1/40000。B6C3Fe ala-bpck是一种常染色体隐性遗传性多囊肾(ARPKD)的动物模型。缺失的TMEM67基因与人类的MKS3以及Wistar大鼠多囊肾模型具有同源性。目的：在确定此模型作为ARPKD研究的可行性后,构建含目的基因TMEM67全长的载体pFlag-CMV-TMEM67.将其转染到HEK293细胞中,使TMEM67过表达,检测HEK293细胞中蛋白的表达,以分析TMEM67在ARPKD中可能参与的信号通路。同时应用基因表达谱芯片筛选与正常小鼠相比,突变体小鼠差异表达的基因,初步探讨TMEM67引起的ARPKD的机制。方法：1设计引物,取小鼠尾尖,进行PCR,鉴定小鼠基因型后,取不同时期WT(野生型)和MUT(突变体)小鼠肾脏,HE染色,观察不同时期小鼠肾脏囊性结构的变化,进一步确定此模型作为隐性遗传性多囊肾研究的可行性。2应用分子生物学实验方法构建含TMEM67全长的载体pFlag-CMV-TMEM67。3培养HEK293细胞,对其转染空载体和含TMEM67全长的载体,经过不同处理后,应用Western Blot实验方法探讨TMEM67引起ARPKD参与的信号通路。4取出生后3天WT和MUT小鼠肾脏组织,应用表达谱芯片技术,筛选出WT和MUT小鼠上调和下调的差异基因。取其中与肾脏发生发展有关的基因,用实时定量PCR (Real time PCR)验证芯片结果的可靠性。结果：1通过对不同时期小鼠肾脏囊性结构的观察发现,小鼠最早在怀孕15.5天时开始出现囊性结构,比Jackson实验室报道的时间要早。随着时间的增长,小鼠肾脏的囊性结构开始扩大。在解剖怀孕18.5的孕鼠时,发现有死胎现象,经过基因型鉴定,是MUT小鼠。在出生后18天,小鼠肾脏组织被囊性结构代替,最终因全身衰竭而死。B6C3Fe ala-bpck作为ARPKD的动物模型是可行的。2应用酶切及凝胶电泳鉴定法,根据酶切片段大小,初步鉴定重组pFlag-CMV-TMEM67质粒序列正确。设计3对引物,对重组质粒进行全基因测序结果显示,构建的载体pFlag-CMV-TMEM67含有TMEM67全长序列。3TMEM67的表达产物Meckelin,不是络氨酸磷酸化蛋白。通过对HEK293细胞中TMEM67的过表达以及不同时期小鼠MUT小鼠肾脏的研究证实TMEM67引起,JNK以及ERK的磷酸化水平的增加。TMEM67在ARPKD中是通过EGFR-ERK和JUK信号通路发挥作用的。而不是通过mTOR信号通路发挥作用的。4用Mouse Genome4302.0Array芯片筛选出表达差异大于1.5倍的基因,其中表达上调的有138个,表达下调的有115个。结论：1B6C3Fe ala-bpck小鼠作为研究ARPKD的动物模型是可行的。2成功构建的载体pFlag-CMV-TMEM67。3TMEM67在ARPKD中是通过ERK和JUK信号通路而不是mTOR信号通路发挥作用的。4表达谱芯片筛选出的差异基因,参与了肾发育和细胞信号通路,其中细胞信号通路包括EGF/TGF通路,a/EGFR通路,TGF-β通路,凋亡通路,整合素介导通路及NF-κβ通路。