本论文的主要工作是建立一个以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型—galB16肿瘤模型。并且在模型成功建立后，运用β-半乳糖苷酶表达载体作为DNA疫苗，在galB16肿瘤模型上进行了初步的抗肿瘤免疫方法的研究。研究工作可以分为几个部分：构建携带β-半乳糖苷酶编码基因的真核表达载体p3gal；p3gal载体稳定转染B16小鼠黑色素瘤细胞，获得稳定表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞；建立表达β-半乳糖苷酶的小鼠galB16肿瘤模型；用免疫方法抑制galB16肿瘤生长的动物实验。 首先通过HindⅢ和BamHI限制性内切酶双酶切从Promega公司的质粒pSV-β-Galactosidase control vector上切下完整的β-半乳糖苷酶编码基因，插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点的HindⅢ和BamHI酶切位点之间，得到重组载体p3gal。经过酶切和测序鉴定后，按照Qiagen质粒纯化试剂盒提供的方法抽提p3gal，以Qiagen质粒纯化柱纯化后，瞬时转染小鼠黑色素瘤B16细胞，48小时后X-Gal细胞染色结果显示有细胞呈蓝色，即表达β-半乳糖苷酶。从功能上验证了构建的p3gal载体含有能够在真核细胞中表达的β-半乳糖苷酶编码基因。 进一步用纯化的p3gal表达载体稳定转染B16细胞。通过G418压力筛选来得到稳定转染了外源基因的单细胞克隆。然后对得到的各个单细胞克隆进行X—Gal细胞染色鉴定，表达β-半乳糖苷酶的细胞将呈蓝色，很容易在光学显微镜下区别出来。通过这种方法，我们获得了能够表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株。 表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株继续在G418压力下培养，到足够的细胞量后接种到C57小鼠背部皮下，成功地建立了肿瘤模型。取肿瘤抽提基因组DNA用β-半乳糖苷酶基因引物从基因水平上进行PCR扩增鉴定，鉴定结果表明所建立的肿瘤基因组中含有β-半乳糖苷酶编码基因片断。然后取肿瘤组织做10 μm冰冻切片，对切片进行X—Gal组织染色鉴定，结果肿瘤组织切片可以染成蓝色。从功能水平上证明所建立的肿瘤模型表达β-半乳糖苷酶。至此，以β-半乳糖苷酶为肿瘤标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型—galB16肿瘤模型成功地建立浙江大学硕士学术论文了。 成功建立表达p一半乳糖昔酶的小鼠ga1B16肿瘤模型后，后续工作就是在该模型上，针对p一半乳糖普酶设计免疫疫苗的抗肿瘤免疫方法的研究。在本论文中，我们也设计了一组动物实验初步观察了以p一半乳糖普酶表达载体作为DNA疫苗进行抗肿瘤免疫的效果。实验分为四组，分别采用以下方案免疫小鼠:l)注射生理盐水作对照;2)注射DNA疫苗即p3gal表达载体(IOOp留小鼠);3)注射免疫佐剂CpG 1826(ZOp留小鼠);4)同时注射DNA疫苗和免疫佐剂。实验结果显示队半乳糖营酶表达载体作为DNA疫苗可以抑制galB 16肿瘤的生长，免疫佐剂CpG 1826能够增强ONA疫苗的作用。这一结果表明，我们可以把p-半乳糖营酶当作galB 16肿瘤的内源性抗原，在这一模型上进行针对p一半乳糖昔酶肿瘤抗原的抗肿瘤免疫的研究，主要是抗肿瘤免疫方法的探索、新型抗肿瘤免疫佐剂的鉴定等。