研究背景与目的体液中稀有肿瘤细胞可提供关于肿瘤的丰富信息,对肿瘤的诊断、治疗指导和复发监测具有重要意义。目前常用的稀有肿瘤细胞鉴定方法主要是免疫细胞化学法和形态学方法,这些方法灵敏度低,操作较为繁琐,成本较高,稳定性较差,这极大地限制了稀有肿瘤细胞在临床的实际应用。因此,亟需开发更理想、灵敏、普适的稀有肿瘤细胞鉴定新方法。研究发现,肿瘤细胞内存在着能量代谢的异常改变,且有研究表明肿瘤这种异常代谢可能与其侵袭转移能力有潜在相关性。研究代谢活跃的肿瘤细胞对肿瘤的诊断、治疗及预后具有十分重要的意义。此外,肿瘤组织的核苷酸代谢明显较正常组织活跃。因此,基于核苷酸代谢异常有望为肿瘤细胞的检测提供新思路。近年来,有科研人员引入“点击化学”开发了分析RNA合成的新方法—基于5-乙炔-尿苷（5-ethynyluridine,EU）的点击化学反应标记新生RNA的方法。EU是一种尿嘧啶核苷类似物,它可在RNA聚合酶的作用下掺入细胞内新合成的RNA中,随后EU与带叠氮基团修饰的荧光染料发生点击化学反应,进行RNA检测,该方法已广泛用于细胞转录活性的检测。基于以上研究背景,本研究从肿瘤代谢功能学角度出发,鉴于细胞转录活性差异,基于EU标记新生RNA的点击化学反应,提出了一种快速、灵敏、普适的肿瘤细胞标记鉴定新技术,并在临床浆膜腔积液中分析该方法的诊断价值。研究方法1.利用Cell-Counting-Kit-8试剂盒分析EU对MCF7肿瘤细胞的细胞活力的影响;通过浓度与孵育时间的不同组合,利用流式细胞术,比较白细胞和肿瘤细胞在不同条件下与EU共孵育后染色的荧光强度,优化最适实验条件。2.通过共聚焦显微镜成像、流式细胞术分析EU对多种肿瘤细胞和白细胞标记效率及成像效果差异;结合免疫荧光染色和Hoechst染色进行共定位成像分析;通过共聚焦显微镜成像、Image J软件分析比较EU标记后染色和免疫荧光染色的标记效率及成像效果。3.以MCF7细胞和MG63细胞为例,在白细胞中掺入不同数量的肿瘤细胞,进行回收实验,分析EU对肿瘤细胞的检测效能。4.收集24例良恶性浆膜腔积液标本,基于EU标记新生RNA的点击化学反应对胸腹水标本进行染色成像和分析,研究该标记肿瘤细胞的新方法在良恶性浆膜腔积液中的诊断价值。实验结果1.EU具有较好的生物相容性;通过流式细胞术分析发现细胞单独与1 mM的EU孵育1h时,肿瘤细胞和白细胞的平均荧光强度差异最大,可达38倍,因此,该条件为最适实验条件。2.通过分析各细胞荧光图像发现EU对肿瘤细胞具有较高的标记效率和良好的成像效果,流式细胞术量化分析提示肿瘤细胞与白细胞混合与EU共孵育后,肿瘤细胞平均荧光强度是白细胞的3.3-5.5倍,肿瘤细胞与白细胞间具有稳定且较明显的荧光差异;共定位成像分析提示EU+/CK+的细胞为肿瘤细胞,具有很好的共定位;通过细胞成像和Image J软件分析,将该方法与免疫荧光染色做对比研究,与免疫荧光法仅能标记识别部分上皮表型的肿瘤细胞相比,EU可标记各种不同表型的代谢活跃的肿瘤细胞,呈现明亮的红色荧光,具有优越的成像效果。3.回收实验结果显示,MCF7细胞的回收率达94.2±2.9%,MG63细胞回收率达92.8±3.6%,均有较高的回收率及鉴定效率。4.利用EU对24例良恶性浆膜腔积液标本进行标记后染色分析。在良性胸腹水标本中,EU+的细胞数量较少,约为0-4个/mL,而在恶性胸腹水标本中,EU+的细胞明显增多,可达6-1435个/mL,数量差异具有统计学意义（p＜0.0001）。共聚焦成像显示EU可相对特异性地标记、区分高代谢肿瘤细胞,成像效果良好。基于EU标记肿瘤细胞的新方法对良恶性浆膜腔积液的鉴别具有良好的诊断价值。结论基于细胞转录活性差异,利用EU标记新生RNA的点击化学反应,我们成功开发了一种快速、灵敏、普适的鉴定肿瘤细胞的新方法。该方法可标记、鉴定不同表型的代谢活跃的肿瘤细胞,成像效果优越,并成功应用于临床良恶性浆膜腔积液的鉴别诊断,为肿瘤早期诊断和代谢监测提供新手段,具有广阔的应用前景。