RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）的结构和功能是当今生物医学研究领域的前沿热点之一,RBP研究领域的一些新发现在多个层面上更新了我们对于生命过程与本质的认知。蛋白质与RNA的相互作用具有普遍性,除了经典的RBP之外,很多信号通路蛋白、转录/翻译调控蛋白、染色质调控蛋白等也可以与不同种类的RNA分子如非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）结合。这种RBP-RNA以及其它蛋白质-RNA相互作用在不同层面调控基因的表达,进而影响机体正常生理发育和病理变化。例如,RBP对于免疫系统的发育和功能起着至关重要的调节作用,在恶性肿瘤和自身免疫疾病中,RBP也越来越展现出其在新疗法中作为潜在靶点的巨大潜力。随着RNA和RBP研究技术的革新,“RNA-RBP相互作用组（RNA-RBP interactome）”概念被提出,以相互作用组学分析为切入点给我们对RNA-RBP相互作用在天然免疫及炎症反应中的效应及机制的相关研究提供了新思路。但是,原本从单一特定的RNA或RBP入手的筛选鉴定方法,已经不能满足我们在疾病模型中开展关于RNA-RBP相互作用组的研究探索。因此,为了研究RNA-RBP相互作用组在炎症反应中的动态变化,进而挖掘出有关键调控作用的分子,新的无偏倚（unbiased）RNARBP复合物的提取和鉴定方法亟待建立。巨噬细胞在人体局部的炎症反应和全身炎性疾病中起着非常关键的作用。巨噬细胞能够表达多种与抗原摄取相关的表面分子,如Fc R、补体受体、甘露糖受体、清道夫受体和Toll样受体等。此外,巨噬细胞摄取抗原的能力很强,能通过吞噬作用、胞饮作用和受体介导的胞吞作用摄取抗原。同时,巨噬细胞也表达大量MHCⅠ、MHCⅡ类分子和CD80、CD86、CD40等共刺激分子,能在细胞内加工处理外源性抗原,形成抗原肽/MHCⅡ类分子复合物表达在细胞表面提呈给T细胞。当然,巨噬细胞在天然免疫应答和炎症启动与消退中的重要作用与相关机制更是生物医学界研究的重大课题之一。在炎症消退过程中,局部组织定居的巨噬细胞可以发生相应的信号通路激活和表型转换,显示出巨噬细胞良好的可塑性。近些年,随着代谢组学技术的不断进步,对炎症反应和炎性疾病中巨噬细胞发生的代谢重塑（也称为代谢重编程,metabolic remodeling）的研究和认知也不断深入。越来越多的研究结果表明,巨噬细胞激活过程中,代谢重编程具有关键作用。尤其是在促炎巨噬细胞及抗炎巨噬细胞中均需要糖代谢的参与。同时脂肪酸氧化过程不仅能够支持抗炎反应,而且也可以驱动促炎巨噬细胞中炎症小体的激活。白细胞介素1β（IL-1β）作为巨噬细胞分泌的一种重要的炎性因子,也参与到巨噬细胞在多种炎症状态和疾病中的调控过程,尤其是类风湿性关节炎这一疾病,其激活巨噬细胞产生炎症后,代谢状态的改变及意义尚有待于深入研究。同时,IL-1β在炎症反应中启动炎症信号后,RBP是否参与炎症反应消退,消退的过程是否存在主动的调控机制,这些调控机制如何运作,又是否和巨噬细胞中的代谢重塑有关,在炎症消退的过程中,RNA-RBP相互作用是否作为一种分子水平上的调控机制发挥作用,这些科学问题的深入探索与解决将为炎症疾病的防治提供新的思路与靶标。为了回答上述问题,我们在IL-1β刺激的小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derive macrophage,BMDM）建立的炎症细胞模型中,通过加大原代细胞取材、优化质谱前肽段水解条件、增加超滤纯化质谱前肽段样品、使用高灵敏度的4D LFQ定量蛋白质质谱等手段,改良已有的利用Trizol试剂分离中间相捕获“RNA-RBP复合物”的技术,以期建立和完善原代细胞中分离紫外交联的RNA-RBP复合物的实验体系。我们对获取的RBP质谱数据进行了筛选分析。我们重点筛选在IL-1β刺激的小鼠骨髓巨噬细胞炎症反应后期的差异潜在RBP分子,通过设计和转染小干扰RNA（si RNA）,敲低BMDM细胞中相应的蛋白表达,确定了调控作用最为显著的一种RRP1（ribosomal RNA processing 1）的RBP分子作为研究对象。接着我们确证了在小鼠及人类的巨噬细胞中,RRP1敲低导致炎性细胞因子IL-1β、IL-6、趋化因子CCL2的表达增强,提示RRP1可以促进巨噬细胞中IL-1β刺激引起的炎症消退。随后,我们利用CRISPR/Cas9技术,构建RRP1基因敲除的RAW 264.7细胞株,进一步实验证实,相比于WT细胞株,RRP1敲除的RAW 264.7细胞株表达炎性细胞因子IL-1β、IL-6、趋化因子CCL2显著增强,同时WB实验结果显示,IL-1β下游信号通路中关键信号转导分子的磷酸化水平增强。通过在RRP1敲除细胞株中过表达RRP1质粒进行rescue实验,进一步证实RRP1发挥促进炎症消退的作用,其消退作用主要依赖于其Nop52结构域,而Cter结构域发挥的消退功能有限。因为RRP1是从IL-1β触发的炎症反应差异筛选出来的,我们想进一步研究其发挥促进炎症消退作用是否仅仅限于IL-1β触发的炎症反应。为证实RRP1发挥促进炎症消退作用是否依赖于IL-1β途径,我们用LPS及poly（I:C）分别刺激BMDM细胞,发现RRP1促进炎症消退的现象在LPS刺激的BMDM中同样存在。为了完全消除LPS刺激模型中IL-1β的潜在影响,我们使用IL-1R1敲除的BMDM加以LPS刺激进行验证,结果发现RRP1促进炎症消退的作用依赖于IL-1β及其下游信号。为进一步研究RRP1促进炎症消退作用的分子机制,我们通过RIP-seq实验,发现IL-1β刺激前后RRP1结合的差异RNA分子大量富集于代谢途径。非靶向代谢组结果显示,小鼠BMDM细胞受IL-1β刺激后,一碳代谢途径被激活,并且IL-1β刺激引起的炎症反应依赖于一碳代谢。结合代谢组学的结果和RIP-seq的数据,并经过RIP-QPCR的确认,小鼠BMDM细胞受IL-1β刺激后,RRP1与一碳代谢-叶酸代谢关键酶TYMS m RNA的结合显著增强,并且RRP1抑制TYMS的表达。最后,我们使用TYMS的酶活性抑制剂,抑制RRP1蛋白敲除的RAW267.4细胞中TYMS的酶活性,发现促进炎症消退的效应显著降低,确证了RRP1通过抑制TYMS的表达发挥促进炎症消退的功能。综上所述,本项研究在原代细胞中建立并完善使用“分离相”技术的RNA-RBP筛选鉴定技术体系,使得RBP的大规模筛选得以在操作相对困难的原代细胞中进行。应用此技术体系,利用IL-1β刺激小鼠BMDM的炎症反应模型,筛选出了具有促进炎症消退效应的RNA结合蛋白-RRP1,再综合利用RIP-seq和代谢组学分析,证实RRP1通过增强与一碳代谢关键酶TYMS的m RNA结合,抑制TYMS的表达,进而抑制炎症反应中的一碳代谢,从而抑制炎症反应中的代谢重塑,最后起到促进炎症消退的生物学功能。我们的研究为原代细胞中的RBP规模筛选与功能研究提供新的技术体系,为炎症消退的机制研究提供新的探索思路,RRP1促进炎症消退功能的发现为炎症疾病的治疗提供了新的潜在靶点。