猫传染性鼻气管炎是一种急性、高度接触性上呼吸道疾病,其病原体猫疱疹病毒Ⅰ型（Feline herpesvirus1,FHV-1）主要感染猫及猫科动物,幼猫病死率可达50%。同其他疱疹病毒科成员一样,FHV-1可潜伏于宿主三叉神经、视神经、颌下淋巴结等部位,造成持续性、潜伏性感染,导致感染猫终生带毒。一旦机体抵抗力下降,便会面临病毒再次活化以及向外排毒的风险。同时FHV-1常与其他病毒,如猫杯状病毒（Feline calicivirus,FCV）引起混合感染,进一步提高了死亡率,严重危害着猫及猫科动物的健康。目前国内针对FHV-1的检测方法主要为PCR或荧光定量PCR,虽然在技术成熟度方面有着较大优势,但对精密仪器、专业人员的依赖以及高昂的成本使其在临床应用方面仍具有一定的局限性。因此,有必要建立简单、快速、适用于宠物医院或基层单位的FHV-1核酸检测方法,以便宠物医生快速诊断疾病从而制定有效的救治方案。重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）与其他核酸扩增技术相比,具有检测时间短、无需精密仪器、结果读取多元化等优点。本研究选取多株FHV-1流行毒株序列,并使用Meg Align软件对其进行比对分析。选取FHV-1高度保守的TK基因作为靶基因,利用RAA等温扩增技术指数倍放大靶标,并分别与免疫层析试纸、家用便携式血糖仪（PGM）、CRISPR/Cas12a技术相结合,建立了三种靶向FHV-1 TK基因的核酸可视化检测方法。主要研究结果如下:1.FHV-1 RAA-VF检测方法的建立及评价。结合RAA与免疫层析试纸,建立了一种针对FHV-1 TK基因的RAA-VF核酸可视化检测方法。前期设计并合成标记有FITC、生物素的特异性引物对,经RAA扩增获得双标记的扩增产物,再利用固定有FITC抗体和链霉亲和素的核酸检测试纸实现双标记扩增产物的可视化判读。该方法在42℃恒温条件下反应20 min即可检测低至14.2 copies/μL的重组质粒和20 TCID50/m L的FHV-1,其敏感性优于普通PCR方法。且该方法与FCV、FPV、FCo V、CAV、CPIV无交叉反应,具有良好的特异性。同时FHV-1 RAA-VF检测方法无需特殊仪器设备,操作简便,仅需约5 min就可以从封闭式一次性核酸可视化试纸装置读取结果,实现对FHV-1的快速可视化检测。2.FHV-1 RAA-PGM检测方法的建立及评价。利用RAA技术与生物传感技术,建立了基于家用血糖仪（PGM）的FHV-1 RAA核酸可视化检测方法（RAA-PGM）。根据蔗糖转化酶可以将蔗糖转化为葡萄糖的原理,在RAA反应后引入5’端偶联蔗糖转化酶且与上游引物序列互补的探针,通过磁珠分离互补结合的引物-探针,在加入底物蔗糖后,反向检测未参与反应的上游引物的剩余量,间接实现FHV-1的检测。该方法在42℃恒温条件下,最低可检测到14.2 copies/μL的重组质粒,敏感性优于普通PCR方法。同时特异性实验结果显示,该方法与FCV、FPV、FCo V、CAV、CPIV无交叉反应。由于PGM替代了精密供电设备,不仅降低了检测成本,同时实现了对FHV-1的可视化半定量检测。3.FHV-1 RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立及评价。将RAA等温扩增技术与CRISPR/Cas12a系统相结合,建立了FHV-1 RAA-CRISPR/Cas12a核酸快速可视化检测方法。首先设计并筛选了特异性识别FHV-1的cr RNA,利用Cas12a在cr RNA引导下可结合RAA扩增产物并激活其反式切割活性,切割FAM-BHQ标记的ss DNA释放荧光,实现了FHV-1核酸的快速检测。该方法在42℃恒温条件下,仅需要40 min即可检测到低至1.42copies/μL的FHV-1重组质粒,与FCV、FPV、FCo V、CAV、CPIV核酸无交叉反应,具有良好的特异性。该方法反应过程中无需开盖,避免了气溶胶污染,通过肉眼可见的荧光信号实现对FHV-1的可视化检测。综上所述,本研究靶向FHV-1 TK基因,以RAA扩增技术为基础,结合不同结果读取方式建立了三种简单、快速、敏感的核酸可视化检测方法,为猫传染性鼻气管炎在基层实验室、宠物医院,甚至实现家庭自测提供了技术支持。