研究背景血栓栓塞性疾病是一种典型的心脑血管疾病,临床病症表现为缺血性脑梗死、心肌梗死、静脉血栓栓塞等。血栓栓塞性疾病的特点是潜伏期长、发作速度快且致死率高,往往患者因为无法得到及时、有效的治疗而丧失完全康复的机会。现今临床上主要应用抗血小板药物、抗凝血药物和溶栓药物治疗血栓栓塞性疾病。课题组前期在方格星虫（Sipunculus nudus）体内发现一类具有纤溶活性的天然方格星虫纤溶酶（Sipunculus nudus fibrinolytic enzyme,snFE）组分,但缺乏高纯度的分离纯化和酶活性机制研究。本课题探索对方格星虫活性成分的纯化工艺,分离天然纤溶酶蛋白并开展酶活性研究,为后续生物信息学分析、基因工程研发提供新的路。研究方法根据方格星虫的生长环境、蛋白相对分子质量大小及等电点差异进行层析和超滤,实现对纤溶酶的纯化。通过电泳和Bradford测定法鉴定蛋白浓度、纯度和分子量。通过电泳和纤维蛋白平板实验,研究纤溶酶本身是否具备纤溶活性和激酶活性。探索各种抑制剂对纤溶酶的作用情况,推断纤溶酶的纤溶机制和活性功能基团。最后,在石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance,QCM）和非变性电泳（Native-PAGE）对纤溶酶进行蛋白结合作用测定,探索其与纤维蛋白原的结合过程。研究结果（1）在方格星虫体内分离出一种纤溶酶snFE1,比活力约为46834.76 U/mg,纯化倍数约为3.96,回收率约为4.56%,相对分子质量约为24.4641 kDa。（2）snFE1具有显著的纤溶活性和激酶活性。snFE1可以快速降解纤维蛋白原和纤维蛋白的α、β链;snFE1激活纤溶酶原水解为接近30 kDa的纤溶酶,在纤维平板上表现出纤溶活力。（3）α2-抗纤溶酶（α2-Antiplasmin,α2-AP）对snFE1纤溶活力和激酶活力具有抑制作用,纤溶酶原激活物抑制剂1（Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）也抑制snFE1的激酶活力,丝氨酸蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂对snFE1纤溶活性和激酶活性具有抑制作用。（4）snFE1与纤维蛋白原间存在直接结合作用,与丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF也存在直接结合作用。PMSF的存在能显著抑制snFE1的纤溶活性,但Native-PAGE实验表明,不影响snFE1与纤维蛋白原的直接结合。研究结论（1）本课题成功建立一条便捷纯化高纯度纤溶酶的工艺路线,从方格星虫的肠腔组织及肠腔液混合物中分离出一种纤溶酶snFE1。（2）通过电泳和纤维蛋白平板实验分析,snFE1在有无纤溶酶原的条件下都有降解纤维蛋白的能力,具有成为直接溶栓药物和纤溶酶原激活剂的研发潜力。（3）α2-AP和PAI-1二者可作为snFE1的抑制剂,调节snFE1在溶栓过程中的效力,保证了 snFE1作为溶栓药物的受人体纤溶系统调控。选择了 10种蛋白酶抑制剂对snFE1进行作用,丝氨酸蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂具备抑制作用,说明snFE1可能是一种丝氨酸蛋白酶,同已发现的动物纤溶酶属于同一蛋白酶家族。（4）从QCM和蛋白电泳实验中,都可以发现snFE1与纤维蛋白原间存在结合作用,snFE1通过吸附在纤维蛋白原上发挥纤溶作用。PMSF蛋白酶抑制剂可以通过结合snFE1以此来达到抑制snFE1纤溶活性,丝氨酸功能基团可能是其重要活性位点。研究意义在课题组前期研究的基础上,本课题通过对蛋白纯化工艺的摸索,研究出快捷、有效的纯化技术路线,分离得到的snFE1具有显著纤溶酶性和激酶活性。且通过分析snFE1受抑制剂的作用效果与同纤维蛋白原间的相互作用,探索snFE1的作用机制和功能基团,为后续天然蛋白的纯化和重组snFE1的开展提供了理论基础和科学依据。