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胰岛素样生长因子I(IGF-I)在哺乳动物胚胎发育中起着非常重要的作用。研究表明适当浓度的IGF-I能够提高体外培养的卵母细胞的成熟率，并通过抗凋亡作用提高体外胚胎的存活率，增加囊胚内细胞数目。但其作用机理还知之甚少。转基因动物和基因干扰技术作为研究基因功能的重要手段，可以用来探究基因在牛胚胎发育过程中的作用机理。为了阐明IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的功能，本研究利用转基因技术，用脂质体和电击法将过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1和干扰载体pGCsi-IGF1导入牛胎儿成纤维细胞中，筛选得到稳定表达细胞株，为建立过表达IGF-I和低表达IGF-I的胚胎提供核供体，构建转基因胚胎模型探讨IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。本研究主要内容包括：
⑴通过RT-PCR方法从牛肝脏总RNA中扩增胰岛素样生长因子I(IGF-I)编码区cDNA序列，以T载体pMD19-T为克隆骨架构建中间克隆载体pMD19-T-IGF1。将IGF-I片段连接在双顺反子载体pIRES2-EGFP的BglII+SalI位点，构建过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1。限制性内切酶分析以及对测序结果表明，本研究所构建的的过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1结构与序列均与预期设计相符合。
⑵针对牛IGF-I基因的第594-622bp区域5-GGCTCAGAAGGAAGTACAT-3设计了一条发夹式RNA干扰片段，连接在干扰载体pGCsilencer-RFP上，构建了干扰载体pGCsi-IGF1。
⑶通过组织块贴附法成功分离出牛胎儿成纤维细胞，利用DMEM+10%FBS培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下体外培养和传代，各代成纤维细胞在DMEM+20%FBS+10%DMSO培养液中冷冻保存；同时详细记录牛胎儿成纤维细胞的形态和生长特性，绘制了第5和10代牛胎儿成纤维细胞的生长曲线，并制作和分析了第5代细胞中期染色体的数目。通过以上分析证明，分离和培养的牛胎儿成纤维细胞在体外培养环境下，随代次增加，生长速度渐缓；第五代染色体数目正常(2n=60)，可以用第五代前的细胞进行转染实验。同时检测了牛胎儿成纤维细胞对筛选药物G418和潮霉素的耐受性，浓度稀释梯度实验结果确定G418的最佳筛选浓度为800μg/ml，潮霉素最佳筛选浓度为50μg/ml。
⑷用脂质体法和电击法转染牛胎儿成纤维细胞，48小时后分析转染效果并进行筛选。利用实时定量PCR技术检测了转染48小时后载体的表达效率，与对照组细胞相比发现，转染过表达载体pIRES2-EGFP-IGF1的细胞中IGF-I表达量显著升高，约是对照组的40倍(P<0.05)，转染干扰载体pGCsi-IGF1的细胞中IGF-I表达量则显著降低，约是对照组的0.023倍(P<0.05)，表明构建的2个载体具有正常的功能，可以进行下一步的筛选。转染48小时后以800μg/ml G418和50μg/ml潮霉素为抗性筛选浓度，在DMEM+10%FBS培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下连续培养10-12天，分别获得了表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的转基因克隆细胞。通过对转基因细胞基因组DNA的PCR扩增，证实外源基因已稳定整合在转基因细胞基因组中，可以用做核移植的核供体细胞，制备转基因胚胎模型，为进一步研究IGF-I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。