【摘 要】
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目的:本研究旨在利用机器学习相关原理对膀胱癌的免疫分子亚型及免疫逃逸的潜在分子机制进行研究,并探索亚型与免疫相关特征的相互联系。方法:从癌症基因组图谱（The Cancer Genomic Atlas,TCGA）数据库中下载膀胱癌转录组数据及单核苷酸变异（simple nucleotide variation,SNV）数据,样本包括412个肿瘤及19个癌旁组织,数据提取和后续分析均使用R 4.0.
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目的:本研究旨在利用机器学习相关原理对膀胱癌的免疫分子亚型及免疫逃逸的潜在分子机制进行研究,并探索亚型与免疫相关特征的相互联系。方法:从癌症基因组图谱（The Cancer Genomic Atlas,TCGA）数据库中下载膀胱癌转录组数据及单核苷酸变异（simple nucleotide variation,SNV）数据,样本包括412个肿瘤及19个癌旁组织,数据提取和后续分析均使用R 4.0.0软件。使用edge R包进行差异表达基因（Differential Expressed Genes,DEGs）分析,通过与从IMMport数据库获取的1830个免疫相关基因进行求交集运算,获得膀胱癌中差异表达的免疫基因。接着,以膀胱癌中差异表达免疫基因的表达谱作为特征变量,使用Consensus Cluster Plus包无监督聚类分析识别膀胱癌免疫分子亚型。通过比较不同亚型的各类临床特征、免疫细胞浸润、检查点基因及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）基因表达、肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden,TMB）等,对比了各亚型之间的各种临床和免疫学特征的差异。然后,对各亚型中差异表达的免疫相关基因进行加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Coexpression Network Analysis,WGCNA）分为不同基因模块,并对各模块内基因进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析以探索与肿瘤免疫分子亚型及不同亚型转化相关的主要生物学通路。最后,我们使用与免疫分子亚型最相关的模块基因作为变量,通过随机森林原理筛选特征变量和构建决策树模型。并随机选择训练集内30%的样本进行内部验证,以及基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）的GSE133624作为外部验证集进行外部验证。结果:对膀胱癌转录组数据的癌与癌旁的差异表达分析得到3203个DEGs,与1830个免疫基因交集运算后筛选得到303个差异表达的免疫基因。以这些基因的表达谱为特征变量,鉴定出4种膀胱癌免疫分子亚型。在四个亚型中,cluster2临床预后较好,免疫细胞、免疫检查点及HLA基因的表达均为最低,即发生免疫逃逸的程度最为严重。对SNV数据的分析显示cluster 2较其他亚型突变频率较高,TMB最高。这些特征均符合免疫治疗应答者的一般特征,提示cluster 2患者的免疫治疗效果较好。而cluster 4各项免疫特征表达较高,与正常膀胱组织的免疫微环境特征相似,发生免疫逃逸程度最轻。接着WGCNA分析将膀胱癌中差异表达的免疫基因分为6个模块,其中棕色基因模块与免疫分子亚型最为相关。KEGG富集分析显示与亚型相关的通路有MAPK、Rap1、Ras、IL-17、Erb B、B细胞受体等,这些通路参与了膀胱癌免疫逃逸及免疫分子亚型的形成。最后,通过随机森林原理筛选棕色模块内的ANXA6,NRP2,TGFB3,GREM1及FGF7五个基因作为特征变量构建决策树模型,其在训练集中准确性为90.5%,内部验证准确性为91.8%。对外部验证集GSE133624的分析显示,预测的各亚型的患者免疫特征与训练集中保持较高一致。这说明模型具有较好的普遍适用性,可准确预测临床膀胱癌测序患者的免疫分子亚型。结论:本研究主要结论如下:1、膀胱癌患者根据差异表达免疫基因可分为4种亚型,不同亚型患者的临床特征不同,其中cluster 2预后较好,cluster 4预后最差。2、四种免疫分子亚型发生了不同程度的免疫逃逸,其中cluster 2发生免疫逃逸程度最为严重,其次为cluster 1,cluster 3,cluster 4。cluster 4亚型的肿瘤微环境免疫特征与正常膀胱组织几乎类似。3、cluster 2亚型患者群体的各项免疫特征符合免疫治疗应答者的特征,提示该亚型可能有较好的免疫治疗效果。4、与膀胱癌免疫分子亚型及免疫逃逸相关的潜在分子通路有MAPK、Rap1、Ras、IL-17、Erb B、B细胞受体等信号通路。5、通过构建决策树模型,可实现对膀胱癌测序患者进行准确的免疫分子亚型分析及免疫治疗的疗效预测。综上,我们探索了膀胱癌的免疫分子亚型及其亚型分化的潜在分子机制,这些结果可能为膀胱癌免疫治疗策略的制定提供指导。
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