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背景及研究目的： 血-脊屏障（blood-spinal cord barrier,BSCB）的完整性和功能性在脊髓损伤后修复过程中发挥着至关重要的作用，这也是创后难以愈合的重要原因。研究表明糖尿病会降低内皮细胞的功能性，增加BSCB的通透性，使得大鼠在发生脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后，BSCB功能性改变更加严重。内质网应激（ER Stress）发生在脊髓损伤的早期阶段，对创后的愈合和细胞存活影响巨大。4-苯基丁酸（4-PBA）属于内质网应激抑制剂，在本实验中作用于脊髓损伤的SD大鼠模型，部分逆转发生在脊髓损伤早期的内质网。因此，本文旨在阐述抑制内质网应激能够缓解紧密连接（tight junction, TJ）蛋白，和粘附连接（adhere junction, AJ）蛋白的降解，保护糖尿病大鼠在脊髓损伤后，血-脊髓屏障的损伤。 研究方法： （1）Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立：雌性SD大鼠称重后随机分成实验组（1型糖尿病组，T1DM）和对照组。禁食14h后，T1DM组单次腹腔注射1%链脲佐菌素柠檬酸钠混悬液（60 mg/kg），CON 组注射等量柠檬酸钠溶液（1ml/kg），在注射前和注射后的1，2，3，4周，需要对所有大鼠的血糖值和体重进行测量记录。注射链脲佐菌素1周后，使用血糖仪测量大鼠血糖评价造模成功率，选取测量平均值在16.7mmol/L以上的SD大鼠作为I型糖尿病模型。 （2）SD大鼠脊髓损伤模型的建立：雌性SD大鼠随机分为假手术组（SHAM）和模型组（SCI），同时将T1DM组随机分为糖尿病模型组（SCI+DM）和糖尿病治疗组（SCI+DM+PBA）。实验组SD鼠在注射STZ四周后进行脊髓损伤造模，采用脊髓夹闭损伤法，锥板切除术暴露T8-T10段脊髓，用15 g夹闭规格动脉夹夹闭T9节段脊髓2min，将4-PBA用100％ DMSO溶解，并用无水乙醇稀释成溶液，在SCI+DM+PBA组造模完毕后立即腹腔注射配制的4-PBA溶液，每日一次，连续四周（100 mg/kg），其余组注射等量DMSO及无水乙醇溶液作为溶剂对照。SHAM组进行除夹闭损伤之外的手术步骤。为了测量SCI后大鼠后肢运动功能的恢复水平，在术后第1,3,7,14,28天进行(Basso Beattie Bresnaha,BBB)评分及斜板实验；同时，为了检测内质网应激相关蛋白和TJ, AJ蛋白的水平，需要在上述时间点处死大鼠取脊髓并收集组织，分别进行伊文思蓝染色，Western blot，免疫荧光等检测。 （3）人脑内皮细胞（Human Brain Microvascular Endothelial Cells，HBMEC）的高糖(HG)诱导模型的建立：将原代人脑微血管内皮细胞用完全培养基在37℃，5％ CO2中培养至70％左右细胞融合，分为对照组CON和高糖诱导组HG，高糖组在ECM中添加终浓度为20mg/mL的葡萄糖，培养12h后加入终浓度为1mmol/L的4-PBA和终浓度为100μmol/LH2O2，再培养2h即可。本实验涉及的主要连接蛋白有紧密连接蛋白，粘附连接蛋白，和内质网应激相关蛋白，主要的检测手段为Western blot和免疫荧光染色。 实验结果： (1) 实验结果表明，糖尿病严重影响脊髓损伤的愈后过程。大鼠 SCI后1, 3, 7, 14, 28天的运动功能恢复测试（BBB评分、斜板实验的评分）结果显示，SCI+DM组大鼠的愈后远差于单独SCI处理组的大鼠。使用伊文思蓝染色在脊髓组织中透过BSCB的渗漏程度检测BSCB的通透性，渗漏图和荧光图结果均显示，SCI破坏BSCB的完整性，提高其通透性，而SCI+DM组的染料渗漏程度更加严重，通透性更高，显示糖尿病会进一步破坏BSCB。在本实验中对维持BSCB功能性的关键因素进行研究，包括微血管及周细胞覆盖率。CD31和PDGFR-β的Western blot和免疫荧光染色结果示，在SCI 1天后与SHAM组相比， SCI组中CD31标记的微血管数量减少，周细胞标记物PDGFR-β的表达量显著下；脊髓切片显示，SCI+DM组的CD31和PDGFR-β表达比SCI组更低。AJ和TJ蛋白的Western和免疫荧光染色结果示，SCI会导致这两种蛋白大量降解，而SCI+DM组比与单独SCI组下降更明显。此外，SCI后，SCI+DM组内质网应激相关蛋白上调幅度更为明显，显示糖尿病会在SCI后进一步启动内质网应激的激活。 （2）基于初步的研究结果，使用内质网应激抑制剂4-PBA后，给药组可以明显抑制糖尿病大鼠在SCI后BSCB的崩解。在BSCB的通透性检测中，抑制内质网应激使SCI+DM+PBA组伊文思蓝染液的渗漏程度明显低于SCI组和SCI+DM组；后肢运动功能测评（BBB评分和斜板实验评分）结果示，SCI+DM+PBA组在造模28天后比SCI组和SCI+DM组有明显提高。对TJ和AJ的研究中发现，抑制内质网应激可以显著降低SCI中糖尿病导致的连接蛋白水平。此外，Western blot和免疫荧光结果显示，PBA治疗在一定程度上减少SCI后脊髓内微血管丢失，提高了周细胞覆盖率，有助于维护BSCB的完整性和功能性。体外实验结果显示，4-PBA治疗可以有效缓解受到H2O2损伤高糖诱导的人脑微血管内皮细胞AJ蛋白和TJ蛋白的丢失。本实验从细胞层面阐述抑制内质网应激有利于血管内皮细胞的损伤后再修复。 实验结论： 糖尿病通过激活内质网应激加剧脊髓损伤后血-脊髓屏障的破坏，而内质网应激抑制剂 4-PBA可以通过抑制内质网应激，在不改变大鼠血糖水平和体重的同时，对SCI后崩坏的血-脊髓屏障起到保护作用，利于创伤愈后。