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肠道是哺乳动物重要的消化器官。肠道行使的功能包括吸收消化营养物质、分泌激素和抵御病菌入侵。肠道上皮的更新速度很快,肠道干细胞维持肠道生理状态下的自我更新,并逐渐分化为肠上皮吸收细胞、分泌粘液的杯状细胞、分泌激素的肠内分泌细胞和与干细胞相间排列的潘氏细胞等。肠道在射线照射、机械压力、感染、炎症等情况下容易受到损伤。低剂量射线诱导的肠道损伤发生后,对射线敏感的Lgr5+肠道干细胞消融,对射线不敏感的Bmil+干细胞、祖细胞或分化细胞去分化,进而完成肠道损伤修复过程。射线诱导的肠道损伤再生过程主要包括DNA双链断裂、ATM启动P53介导的细胞周期检验点激活、细胞周期停滞和损伤修复等事件。Cullin RING ligase(CRL)复合物是目前已知的哺乳动物中最大的E3泛素连接酶复合物家族,在蛋白质泛素化和泛素介导的26S蛋白酶体降解途径中发挥重要作用。CUL4B作为其支架蛋白,其N端与DNA损伤结合蛋白DDB1相连,而DDB1可以招募各种底物识别蛋白(DDB1-and CUL4-associated factor,DCAF),以特异性识别底物。而CUL4B的C端与ROC1结合,并可被NEDD8修饰,ROC1负责桥连E3酶与E2泛素结合酶,使泛素与底物连接。CRL4B复合物参与多种生物学过程,课题组前期结果表明,CUL4B一方面在肠道稳态维持和干细胞命运决定中起重要作用;另一方面,CUL4B缺失小鼠在射线诱导的损伤再生过程中应答异常。然而CRL4B复合物参与肠道功能调控的具体机制仍不明确。本研究工作利用蛋白组学技术鉴定CUL4B影响肠道功能的调控蛋白和结合蛋白,通过生化及分子生物学手段探究CRL4B复合物参与肠道稳态调控和损伤修复的具体分子机制。基于以上研究目的,本论文工作分为以下两个部分:1.CRL4B复合物参与肠道稳态维持的泛素化降解底物鉴定。为了探究CUL4B通过26S蛋白酶体途径参与肠道功能调控的具体泛素化降解底物,本研究提取肠上皮特异性敲除Cul4b与同窝对照小鼠的小肠组织进行差异蛋白质组学和泛素化差异蛋白质组学分析,通过对Cul4b敲除后表达显著上调的蛋白和泛素化修饰水平显著下调的蛋白进行综合分析,本文鉴定出IRGM1为CUL4B参与肠道稳态调控的候选泛素化降解底物。为了进一步明确CRL4B复合物调控IRGM1的具体分子机制,本文应用免疫共沉淀实验证实IRGM1与CRL4B复合物存在相互结合。通过半衰期和MG132处理实验证实CUL4B通过26S蛋白酶体途径降解IRGM1。泛素化实验进一步证实IRGM1为CUL4B的泛素化降解底物。根据蛋白组学结果构建点突变质粒进行泛素化实验,本文明确IRGM1的泛素化修饰位点为第270位赖氨酸。此外,CUL4B结合蛋白的质谱分析结果中存在多种WD40蛋白,本文通过免疫共沉淀实验验证WDR77与CRL4B复合物存在相互结合,WDR77是CRL4B复合物识别IRGM1的DCAF。CRL4B复合物与WDR77结合,对IRGM1进行泛素化修饰和26S蛋白酶体降解。综上,CRL4B复合物通过WDR77靶向底物IRGM1,在其K270位点进行泛素化修饰和26S蛋白酶体降解,以此参与肠道稳态维持和调控。2.CUL4B在射线诱导的肠道损伤修复过程中的动态作用。在体内和体外的射线诱导的肠道损伤再生模型中,本文发现CUL4B在射线诱导的肠道损伤修复过程中表达先升后降,射线照射后Cul4b敲除小鼠较野生型小鼠生存率低、损伤严重,但修复过程加快。未照射条件下,CUL4B缺失导致P53介导的凋亡增加;射线诱导的损伤发生后,CUL4B缺失导致P53介导的凋亡减少,提示CUL4B在肠道损伤修复中发挥动态作用。通过对射线照射前后CUL4B结合蛋白的质谱分析,本文发现参与P53调控的重要蛋白PSME3在未损伤条件下与CUL4B结合,而损伤后与CUL4B不再结合。本文通过免疫共沉淀和Duolink PLA实验验证了二者的结合情况。结合蛋白组学结果,本文通过泛素化、半衰期等实验验证了 CUL4B抑制PSME3的泛素化并正向调控其表达。拯救实验证实CUL4B协同PSME3调控P53介导的凋亡。为了明确CUL4B在损伤发生后的作用,本文对照射前后的小鼠小肠组织切片进行CUL4B的免疫荧光染色,发现CUL4B在辐照损伤后入核。本文进一步对小肠组织亚细胞组分蛋白进行分离,发现CUL4B在辐照损伤后结合到染色质上。CUL4B的缺失促进BRCA1信号通路的激活,导致γ-H2AX与P53、p-P53的表达显著减少。提取射线照射后3天的Cul4b敲除与同窝对照小鼠小肠组织RNA进行转录组测序,对差异表达基因进行GO分析发现DNA损伤修复通路、组蛋白泛素化修饰通路富集。这些结果表明,损伤修复过程中CUL4B的缺失抑制P53表达和凋亡发生,加速了修复过程。综上,本文阐明了 CUL4B在射线诱导的肠道损伤修复过程中的动态作用与分子机制:当小鼠小肠未受射线照射时,CUL4B与PSME3结合,抑制下游P53介导的细胞凋亡,并且CUL4B抑制PSME3的泛素化修饰,使PSME3积累,进一步加强其对P53的负调控。当小鼠小肠受到射线照射后,CUL4B与PSME3解离,入核结合到DNA损伤部位,参与组蛋白H2A的泛素化修饰,进而抑制BRCA1磷酸化,阻碍BRCA1信号通路的激活。一方面导致DNA损伤修复受阻,损伤标志物γ-H2AX积累;另一方面,促进P53信号通路,导致P53介导的凋亡增加。本研究运用多种蛋白组学方法,发现了 CRL4B复合物参与肠道稳态维持和损伤修复调控的新底物和新机制。