【摘 要】
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喜树碱(Camptothecin,CPT)是一种天然植物活性成分,属于萜类吲哚生物碱(terpene indole alkaloid,TIA),被称为“20世纪90年代抗癌药物的三大发现”之一,全球范围内的喜树碱临床需求十分巨大。但喜树的生长周期长,导致药源匮乏,茜草科的短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)可以产生喜树碱,使其成为重要的药源植物。本文克隆得到短小蛇根草內源环烯醚萜途径
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喜树碱(Camptothecin,CPT)是一种天然植物活性成分,属于萜类吲哚生物碱(terpene indole alkaloid,TIA),被称为“20世纪90年代抗癌药物的三大发现”之一,全球范围内的喜树碱临床需求十分巨大。但喜树的生长周期长,导致药源匮乏,茜草科的短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)可以产生喜树碱,使其成为重要的药源植物。本文克隆得到短小蛇根草內源环烯醚萜途径中的关键酶基因OpG10H、Op10HGO、OpSLS,分别构建其组成型过表达载体、诱导型过表达载体、干扰载体以及敲除载体,并对短小蛇根草进行遗传转化,研究OpG10H、Op10HGO、OpSLS在喜树碱合成中的功能。本文首次将OpSLS组成型过表达载体与OpG10H诱导型过表达载体共转化短小蛇根草,并利用转基因毛状根对OpSLS,OpG10H两个基因进行功能分析和对比研究。研究发现组成型过表达OpG10H转基因株系中的喜树碱含量最高达到2.40 mg/g,平均含量达到1.56 mg/g,与对照1.4 mg/g相比,提高了11%;同时OpG10H转基因株系中的喜树碱产量也有所提高:喜树碱产量平均达到945.02μg/瓶,与对照相比,各株系中的喜树碱产量分别提高了15%-43%。OpG10H诱导型过表达的毛状根中喜树碱的含量在诱导后达到1.93mg/g,比诱导前平均提高了27.96%,其产量也有一定程度的提高。CRISPR敲除和RNAi干扰OpG10H基因表达的毛状根中的喜树碱含量急剧减少,这些都表明G10H基因确实参与短小蛇根草的喜树碱合成途径,而且是不可缺少的。OpSLS敲除株系中马钱子苷、裂环马钱子苷含量都下降60%以上,喜树碱含量下降幅度高达90%以上,而过表达OpSLS株系的喜树碱平均含量达到2.36 mg/g,与对照相比提高了68.8%,平均产量达到1478.10μg/瓶,与对照相比提高了90.48%,这些结果都表明OpSLS在短小蛇根草的喜树碱合成中具有明显的促进作用。在过量表达OpSLS的转基因株系中,诱导表达OpG10H,喜树碱含量进一步得到提升。比较分析SLS和G10H共表达转基因株系中的喜树碱含量和产量结果,发现SLS,G10H都是喜树碱合成途径中的关键酶,但是SLS可能比G10H具有更重要的作用。过表达10HGO对喜树碱合成的推动效果甚微,但敲除10HGO后,转基因株系中的喜树碱含量反而全部显著提高,考虑到同工酶8HGO的存在,推测10HGO可能在短小蛇根草的喜树碱合成途径中处于次要地位,而8HGO基因更有可能占据更重要的地位。挑选高含量喜树碱株系的喜树碱粗提液利用MTT法进行抗肿瘤细胞活性检测发现,相同浓度的喜树碱粗提液对癌细胞的杀伤性几乎相同,而且喜树碱在抗癌抗肿瘤方面的效果确实要好于对照,这为利用基因工程改良药物植物资源提供了技术支撑,同时将为缓解临床需求和资源紧缺的矛盾提供可能。
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