目的:基于程序性死亡受体-1（programmed death-1,PD-1）抗体在肿瘤免疫治疗领域突破性的治疗效果,我国卫计委在2015年已将PD-1靶点列为国家重大新药创制专项新方向之一。目前获批上市的PD-1抗体都是单克隆抗体,相比于单克隆抗体,分子量小、稳定性高、组织渗透性强、免疫原性低、可在原核系统表达的纳米抗体更适合开发成为PD-1抑制剂。另外,目前尚未有具功能活性的PD-1纳米抗体研究报道,因此本论文希望弥补这一研究空白,本文希望开发具有阻断PD-1/PD-L1途径活性的PD-1纳米抗体候选药物提供材料。方法与结果:（1）应用PCR技术扩增获得人PD-1胞外段基因（PD-1 ECD）,亚克隆至真核表达载体pCMV,构建PD-1 ECD重组蛋白的表达质粒（pCMV-PD-1 ECD）。通过瞬时基因表达和Ni-NTA亲和层析柱纯化获得纯度大于90%、与鼠PD-1mAb、PD-L1有结合活性的PD-1 ECD重组蛋白,用于后续抗体筛选。（2）通过三轮淘洗和PE-ELISA法筛选大容量天然噬菌体纳米抗体库(6.68×10¹¹ CFU/Total)中与PD-1 ECD特异性结合的纳米抗体序列。获得了6个氨基酸序列上存在差异的PD-1 ECD纳米抗体(Nb_{PD-1 ECD}),命名为Nb 1-Nb6。采用生物信息学方法分析Nb_{PD-1 ECD}理化特性,Nb_{PD-1 ECD}分子量在17.7¹8.4kDa之间;理论等电点在5.02⁸.85之间;GRAVY均为负值,为亲水性蛋白质。（3）pMECS-Nb_{PD-1 ECD}转化至E.coli WK6,经IPTG低温诱导表达、渗透压冲击法提取和Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得Nb_{PD-1 ECD}蛋白纯度在92⁹7%。6株Nb_{PD-1 ECD}工程菌产量在2.75⁶.54 mg/L之间。（4）借助ELISA方法研究Nb_{PD-1 ECD}特异性,发现6个Nb_{PD-1 ECD}中Nb 2和Nb 3特异性识别人PD-1分子。Nb 2和Nb 3为PD-1候选纳米抗体,继续研究,两株纳米抗体亲和常数分别为（2.28±1.38）和（4.57±1.64）×10⁷ L/mol（ELISA法检测）。与鼠PD-1 mAb相比,经过相同高温处理后Nb 2和Nb 3的相对活性更高,热稳定性更好,且Nb 2比Nb 3的热稳定性好。（5）竞争ELISA结果显示,Nb 2和Nb 3均能有效阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用,也能竞争抑制PD-1 mAb与PD-1的结合,推测两株Nb_{PD-1 ECD}在PD-1上的结合表位与PD-L1在PD-1上的结合表位、PD-1 mAb在PD-1上的结合表位重叠或者相近,且Nb 2和Nb 3结合PD-1上的区域很可能不一致。（6）细胞水平上,利用DNA重组技术构建pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-PD-1重组质粒,通过慢病毒转染HEK 293T细胞后,经嘌呤霉素压力筛选出HEK293T/PD-1稳定株。借助HEK 293T/PD-1研究Nb 2和Nb 3与天然跨膜形态的PD-1特异性识别活性,流式结果显示Nb 2和Nb 3均能特异性地识别细胞膜表面表达的PD-1,具有与PD-1 mAb相同的结合能力。（7）体外PBMC活化模型中,利用PHA体外激活T细胞,以IFN-γ浓度评价T细胞活化情况,研究Nb_{PD-1 ECD}对PD-L1抑制T细胞活性的阻断效果。结果表明Nb 2和Nb 3能够有效逆转PD-L1引起的T细胞失活状态,保持T细胞活性,进而上调IFN-γ的表达。结论:本文构建了编码人PD-1 ECD重组蛋白的真核表达质粒,通过表达纯化获得纯度大于90%、具有功能活性的PD-1 ECD重组蛋白,并以此为抗原从大容量天然噬菌体纳米抗体库中筛选出两株分子量小、特异性强、亲和力高、热稳定性好的Nb_{PD-1 ECD}（Nb 2和Nb 3）。体外生物活性研究中发现,Nb 2和Nb 3能抑制PD-L1与PD-1分子之间的相互作用,并且能特异识别细胞表面天然构象PD-1,阻断PD-L1与PD-1结合从而保持T细胞活性。综上所述,Nb 2和Nb 3均具有开发成为免疫检查点抑制剂的潜力,为后续肿瘤治疗候选药物提供了物质材料。