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目的:分析课题组已构建成功的亚洲带绦虫六钩蚴Ta18抗原重组枯草芽孢工程菌(Pus186-CotC-Ta18)的免疫应答特征,为阐明亚洲带绦虫六钩蚴Ta18抗原生物学功能和免疫保护的分子机制奠定基础。 方法:使用DSM(Difco Sporulation Medium)培养基诱导Pus186-CotC-Ta18重组枯草芽孢工程芽孢生成,收集芽孢,用1MNaCl洗涤芽孢,加PMSF至终浓度1μmol/L,将芽孢溶于一定量蒸馏水中,68℃1h杀灭残留的枯草杆菌繁殖体。芽孢于-20℃保存备用;提取芽孢外壳蛋白,使用Ta18抗血清,蛋白印迹验证外源蛋白在重组芽孢表面的表达;使用Ta18抗原重组枯草芽孢口服及腹腔注射免疫大鼠:①腹腔注射免疫:30只SD大鼠,随机分为3组,分别为对照组(naive),Pus186-CotC芽孢组(cotc)和Pus186-CotC-Ta18表达芽孢组(cotc-ta18),每组10只,拟分别腹腔注射生理盐水、1×1010pus186-CotC芽孢和pus186-CotC-Ta18表达株芽孢。30只大鼠均取尾血后,分离血清,标记并分装冻存,每组予以第1次腹腔注射。间隔两周免疫一次,共3次,分别于第1、15、32、50天,各组取尾血,分离血清,标记并分装冻存;②口服免疫:选3组SD大鼠,每组10只。分别为对照组,芽孢组,表达株芽孢组。对照组(naive),Pus186-CotC芽孢组(cotc)和Pus186-CotC-Ta18表达芽孢组(cotc-ta18)分别进行口服灌胃生理盐水,1×1010pus186-CotC芽孢和pus186-CotC-Ta18表达株芽孢,在第0、1、2、16、17、18、33、34、35天用灌胃针经口免疫各组大鼠,分别在第1、15、32、50天采集血清样本,用于ELISA检测。设Pus186-CotC-Ta18芽孢组、Pus186-CotC芽孢组及常规感染组,口服免疫家猪,定期收集血清和粪便,ELISA法检测血清中IgG及粪便中 IgA的含量变化。 结果:目的基因在芽孢表面高效表达,被重组蛋白Ta18免疫的SD大鼠血清,具有免疫原性。重组Ta18枯草芽孢杆菌免疫组的大鼠血清细胞因子IFN-γ、IgG明显升高,且腹腔注射组峰值在第15天后出现,早于口服免疫组,体液免疫应答中IgG亚类IgG1升高,并伴有细胞因子IL-12的分泌,IgG2a的升高。各组的IL-4水平差异无统计学意义。家猪粪便中特异性IgA水平显著高于非重组芽孢处理组及常规感染组,但血清IgG升高不明显。 结论:对已经成功克隆表达的Ta18抗原重组枯草芽孢进行了诱导表达,证实Ta18在重组芽孢表达。重组枯草芽孢对各组免疫大鼠,血清特异性IgG、IgG1和IgG2a水平高于对照组;细胞因子IFN-γ、IL-12均升高。重组枯草芽孢能发挥免疫佐剂作用,活化家猪肠粘膜上的相关淋巴组织,使SIgA抗体分泌增强。重组Ta18枯草芽孢杆菌能有效的诱导机体产生免疫应答,包括细胞免疫及体液免疫,为新型抗感染饲料添加剂的研制提供了理论基础。