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神经病理性疼痛（neuropathic pain,NPP）作为一种较常见的临床疼痛类疾病,其治疗具有一定的挑战性。NPP是一类由于脊髓、皮质下和皮质区突触可塑性机制的长期改变而引起的疾病。国际疼痛研究协会世界疼痛大会曾将神经病理性疼痛定义为“由神经系统的原发性损伤或功能障碍所引发或导致的疼痛”。其表现主要以自发性疼痛、痛觉过敏、促诱发痛和感觉异常为特点。在普通人群中,与各类疾病相比NPP的患病率已达8%的较高比例,在我国NPP患者数量就已将近一亿人次;作为类型相对特殊的疼痛已经影响了众多人数,该患病群体在全球约占7-10%。由于NPP的高发病率,已经严重影响了人们的生活质量,因而逐渐得到人们重视,医学研究人员对此也不断深入探索,以求能找到良好的治疗方法,改善患病人群的生活质量。脑前扣带回区（Anterior Cingulate Cortex,ACC）在神经病理性疼痛的发生发展发挥着重要作用,脊髓背角区（Spinal Dorsal Horn,SDH）的神经元兴奋性增强诱导CS。中枢敏化（central sensitization,CS）在NPP的产生和维持中发挥着重要作用。而血清缝隙连接蛋白-1（Pannexin-1,Panx1）-Src-N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）关联是CS的一条新的重要通路。前期研究我们发现川芎能够通过干预Panx1-Src-NMDAR-2B信号通路对神经病理性疼痛模型大鼠中枢敏化发挥一定作用,且川芎也能明显改善NPP中枢痛敏反应,但其作用机制尚不清楚。NPP属于慢性疾病,治疗主要以西医药物治疗为主,如抗抑郁药、抗癫痫药等,但西医的药物治疗短期并不能产生较好的治疗作用,然而长期服药又容易产生药物的依赖性、抗药性及安全性等众多问题。随着近年来国家对中医药的重视及中医中药的进步发展,中医药治疗NPP的疗效较西药治疗显著,且无明显副作用,探索中医药对NPP的治疗具有重要的意义。因此本课题组将继续深入研究,以Grin2 btm1.1（Grin2a）模型小鼠为研究对象,探究川芎在超微物质及分子基因水平对NPP的作用及影响。目的:明确Grin2 btm1.1（Grin2a）小鼠是否可以作为NPP模型小鼠;明确CRE对哪种类型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的Panx1-Src-NMDAR信号通路发挥作用;解释CRE治疗NPP的作用机制,部分阐明川芎临床止痛功效的科学内涵,为寻找有效的NPP中药制剂提供理论依据和方法学支持。方法:第一章野生型与杂合型Grin2 btm1.1（Grin2a）小鼠的比较（1）行为学采用Von Frey hairs、Cold spray、电子压痛法、光照甩尾法及热板实验等方法进行测试,观察野生型和杂合型小鼠足底机械痛阈、冷痛敏、鼠尾压痛、鼠尾热辐射以及足底热痛的差异;（2）应用苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining,HE）和尼氏染色（Nissl staining）法观察两类小鼠脑ACC和脊髓SDH区神经组织的差异;（3）通过微透析实验结合高效液相-荧光色谱法（High performance liquid-fluorescence chromatography,HPLC-FLD）检测比较两类小鼠脑ACC区细胞外液中谷氨酸（Glutamate,Glu）、丝氨酸（D-serine,D-Ser）和甘氨酸（Glycine,Gly）等氨基酸类神经递质的动态变化;（4）通过Western Blot比较两类小鼠脑ACC和脊髓SDH区Panx1、Src、NMDAR-2B的蛋白水平;（5）通过RT-PCR比较两类小鼠脑ACC和脊髓SDH 区 Panx1、Src、NMDAR-2B 的基因水平。第二章 川芎醇提液（Ethanol extract of Ligusticum Chuanxiong,CRE）对野生型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的影响（1）通过行为学测试Von Frey hairs考察CRE对野生型小鼠镇痛活性的影响;（2）应用HE和尼氏染色法观察CRE对野生型小鼠脑ACC和脊髓SDH区组织形态学的影响（3）采用微透析结合HPLC-FLD检测CRE对野生型小鼠脑ACC区细胞外液中Glu、D-Ser和Gly的动态变化影响;（4）通过Western Blot考察CRE对野生型小鼠脑和脊髓两个维度上Panx1-Src-NMDAR相关蛋白分子的变化情况;（5）通过RT-PCR探索CRE对野生型小鼠脑和脊髓两个维度上Panx1-Src-NMDAR相关基因分子的变化影响。第三章CRE对杂合型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的影响（1）通过行为学测试Von Frey hairs考察CRE对杂合型小鼠镇痛活性的影响;（2）应用HE和尼氏染色法观察CRE对杂合型小鼠脑ACC和脊髓SDH区组织形态学的影响（3）采用微透析结合HPLC-FLD检测CRE对杂合型小鼠脑ACC区细胞外液中Glu、D-Ser和Gly的动态变化影响;（4）通过Western Blot考察CRE对杂合型小鼠脑和脊髓两个维度上Panx1-Src-NMDAR相关蛋白分子的变化情况;（5）通过RT-PCR探索CRE对杂合型小鼠脑和脊髓两个维度上Panx1-Src-NMDAR相关基因分子的变化影响。结果:第一章野生型与杂合型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的比较（1）行为学:与野生型小鼠相比,杂合型小鼠的机械痛阈显著性降低（P＜0.01）;杂合型与野生型在冷痛、压痛、热辐射痛及热痛均不敏感,无统计学差异。（2）HE和尼氏染色:HE染色结果显示杂合型与野生型小鼠脑和脊髓组织切片对比无明显差异,神经元细胞数目相当,形态饱满、结构规则完整;尼氏染色结果显示杂合型与野生型小鼠脑ACC和脊髓SDH区中神经元细胞数量较多,结构规则形态饱满。（3）脑细胞外液中Glu、D-Ser和Gly三种氨基酸含量的变化情况:与野生型小鼠相比,杂合型小鼠脑ACC区细胞外液中Glu含量在药前60 min、20 min、药后 140 min、220-300 min明显升高（P＜0.05,P＜0.01）,D-Ser含量在药前20 min、药后260 min明显升高（P＜0.05,P＜0.01）,Gly含量在药前60 min、药后20-100 min明显升高（P＜0.05）;（4）Western Blot检测:与野生型相比,杂合型小鼠脑ACC和脊髓SDH区Panx1、Src、NMDAR-2B的蛋白水平明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;（5）RT-PCR检测:与野生型相比,杂合型小鼠脑ACC区的Panx1、Src和脊髓SDH区Src、NMDAR-2B的基因水平明显升高（P＜0.05,P＜0.01）。第二章CRE对野生型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的影响（1）行为学:CRE、Ifenprodil对野生型小鼠的镇痛活性无影响;（2）在HE和尼氏染色中,CRE、Ifenprodil对野生型小鼠脑ACC和脊髓SDH区均无组织形态学的影响;（3）CRE、Ifenprodil对野生型小鼠脑ACC区细胞外液Glu、D-Ser和Gly三种氨基酸变化含量无影响;（4）CRE、Ifenprodil对野生型小鼠脑ACC和脊髓SDH区Panx1、Src、NMDAR-2B的蛋白无统计学差异;（5）CRE、Ifenprodil对野生小鼠脑ACC和脊髓SDH区Panx1、Src、NMDAR-2B的基因无明显作用趋势,无统计学意义。第三章CRE对杂合型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的影响（1）行为学:与杂合型相比,杂合型小鼠Ifenprodil连续腹腔注射给药10 d后在药后0、60-240 min可显著提高杂合型小鼠的镇痛活性（P＜0.05,P＜0.01）,CRE连续灌胃10 d,CRE-H组在药后30、90～240 min可显著升高小鼠的镇痛活性（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-H在药后 100-140 min、220-300 min能显著性降低杂合型小鼠ACC细胞外液中Glu含量（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-M组在药后120～240 min可显著升高小鼠的镇痛活性（P＜0.01）,CRE-L组在药后60～120 min可升高小鼠的镇痛活性（P＜0.05,P＜0.01）;（2）HE和尼氏染色:CRE、Ifenprodil对杂合型小鼠脑ACC和脊髓SDH区均无组织形态学的影响;（3）脑细胞外液中Glu、D-Ser和Gly三种氨基酸含量的变化情况:与杂合型相比,Ifenprodil在药前60-20min、药后220-3 00min能显著性降低杂合型小鼠ACC区细胞外液中Glu含量（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-H在药后 100-140 min、220-300 min能显著性降低杂合型小鼠ACC区细胞外液中Glu含量（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-M在药后220-260 min能显著性降低杂合型小鼠ACC区细胞外液中Glu含量（P＜0.01）,CRE-L在药后220 min能降低杂合型小鼠ACC区细胞外液中Glu含量（P＜0.05）;Ifenprodil在药前20min、药后220-340min能显著性降低杂合型小鼠ACC区细胞外液中D-Ser含量（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-H在药前20 min导致小鼠ACC区细胞外液中D-Ser含量降低（P＜0.05）,CRE-M在药前20 min和药后20-60 min、260-340 min均能导致小鼠ACC区细胞外液中D-Ser含量降低（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-L在药前20 min和药后220-340 min均能导致小鼠ACC区细胞外液中D-Ser含量降低（P＜0.05,P＜0.01）;Ifenprodil在药前20-60min、药后20-260min能显著性降低杂合型小鼠ACC区细胞外液中Gly含量（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-M在药前20-60 min和药后20-100 min、340 min均能导致小鼠ACC区细胞外液中Gly含量降低（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-L在药前20 min和药后220也能导致小鼠ACC区细胞外液中Gly含量降低（P＜0.05）;（4）Western Blot检测:与杂合型相比,Ifenprodil和CRE-H、M、L能显著降低脊髓SDH区的Src、NMDAR-2B蛋白（P＜0.01）,且CRE对小鼠脑ACC和脊髓SDH区Panx1、Src、NMDAR-2B的蛋白水平均有降低的作用趋势;（5）RT-PCR检测:与杂合型相比,Ifenprodil能显著性降低小鼠脑ACC区Panx1、Src和脊髓SDH区的NMDAR-2B的基因水平（P＜0.01）,CRE-H能显著性降低小鼠脑ACC区Panx1、Src的基因水平（P＜0.05,P＜0.01）,CRE-M能显著降低小鼠脑ACC区Panx1、Src基因和脊髓SDH区的Src、NMDAR-2B基因（P＜0.01）,CRE-L能显著降低小鼠脑ACC区Panx1基因和脊髓SDH区的Panx1、Src基因（P＜0.05,P＜0.01）。结论:1.通过第一章实验研究结果显示与野生型小鼠相比,杂合型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的机械痛阈、脑内Glu、D-ser、Gly等氨基酸含量显著降低、脑ACC和脊髓SDH区Panx1、Src、NMDAR-2B的蛋白以及脑ACC区的Panx1、Src和脊髓SDH区Src、NMDAR-2B的基因水平明显升高,因此确定杂合型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠是可以作为疼痛模型小鼠来进行研究。2.野生型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠用CRE、Ifenprodil干预后无明显差异。3.CRE、Ifenprodil能显著提高杂合型Grin2b tm1.1（Grin2a）小鼠的镇痛活性、明显降低脑ACC细胞外液中Glu、D-Ser和Gly含量、脊髓SDH区的Src、NMDAR-2B蛋白以及脑ACC区Panx1、Src和脊髓SDH区的Src、NMDAR-2B基因的基因水平。因此川芎的中枢镇痛作用可能是通过提高杂合型小鼠的机械痛阈、升高镇痛活性与抑制其脑ACC细胞外液中Glu、D-Ser和Gly的释放,降低脑ACC和脊髓SDH两区域内Panx1、Src和NMDAR-2B蛋白与基因表达,调控脊髓、脑两个水平上Panx1-Src-NMDAR信号通路有关。