目的:原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球癌症发病率第七位,死亡率第二位,其中肝细胞癌占原发性肝癌中90.0%。肝细胞癌的发病机制十分复杂,且缺乏有效的治疗手段,因而肝细胞癌患者术后易复发、转移,其五年生存率仅为15.0%-45.7%。尽管近些年随着分子生物学、病理学和表观遗传学的进展,越来越多的肝细胞癌相关的标记物如:甲胎蛋白(AFP)、磷脂酰肌醇(GPC3)、肝细胞生长因子(HGF)、AFP m RNA、GGT m RNA等被发现并应用于临床,但目前仍缺乏特异性强及灵敏性高的生物学标记物指导肝细胞癌的诊断及治疗。micro RNA(mi RNA)是一种内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用。mi RNA可参与调节细胞分化、细胞侵袭、细胞凋亡等多种细胞功能,并与恶性肿瘤的发生、发展有着密切的关系。每个mi RNA可以有多个靶基因,而几个mi RNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mi RNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个mi RNA的组合起来精细调控某个基因的表达来实现。mi R-32定位于人染色体9q31.3,其在多种恶性肿瘤中表达上调,如前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、肠型胃癌、多发性骨髓瘤等,在恶性肿瘤发生、发展中发挥着重要的致癌作用。但是,mi R-32与肝细胞癌发生、发展的关系尚没有报道。本研究使用新鲜的肝细胞癌组织及相应癌旁组织标本,检测mi R-32的表达情况,并结合患者的临床资料、病理学特征以及生存期资料分析该基因在肝细胞癌发生、进展、临床诊断及判断预后中的意义,为mi R-32在临床中的应用提供理论支持。方法:1研究对象及标本:选取2010年3月-2014年6月于河北医科大学第四医院肝胆外科行手术切除的肝细胞癌患者50例,其中男性46例,女性4例,年龄25-73岁,平均年龄52.8±10.5岁。依据术前一周实验室指标、Child-Pugh分级标准评估肝功能,并确定肝炎类型、肿瘤标记物水平,以影像学和术中所见评估肝硬化有无及肿瘤的特征。肿瘤直径2-15cm。肝功能Child-Pugh A级47例,B级3例。50例患者中Ⅰ期、Ⅱ期共29例,Ⅲ期、Ⅳ期共21例。本组患者中乙型病毒性肝炎表面抗原(HBs Ag)阳性40例,阴性10例;丙型病毒性肝炎抗体(HCV-Ab)均为阴性。所有实验对象在术前均未进行过化疗、放疗或其它抗肿瘤治疗。实验标本共100例,包括新鲜肝细胞癌组织标本50例及相应癌旁肝硬化组织50例。标本留取后立即保存于液氮中,后储存于-80℃冰箱以备使用。所有标本常规石蜡包埋,HE染色,最后由病理科2名主任医师确诊为肝细胞癌及癌旁肝硬化组织。收集患者吸烟史、饮酒史、肝炎病史、家族史等病史,记录患者凝血功能、血常规、肝功能、AFP值、乙肝病史等实验室指标,登记患者肿瘤大小、数目及是否有转移等病理学材料。使用电话联系或信访等途径对患者进行随访,随访期截止至2015年1月。2 mi R-32在肝细胞癌组织及相对应癌旁组织中表达情况的检测:用Trizol法提取总RNA,对RNA样品进行纯度及完整性的测定后将其反转录为c DNA,再采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,检测50对肝细胞癌组织和对应的癌旁组织mi R-32表达情况,mi R-32特异性茎环反转录引物为:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACTGCAACTT-3’;U6特异性茎环反转录引物为:5’-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3’。mi R-32实时荧光定量PCR上游引物为:5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’;下游引物为:5’-GCCGCTATTGCA CATTACTAAGTT-3’。U6实时荧光定量PCR上游引物为:5’-CTCGCTT CGGCAGCACA-3’;下游引物为:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。3统计学分析:使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,采用Kolmogorov-Smimov检验法对数据进行正态分布检验。非正态数据以中位数表示,两组间配对样本采用Wilcoxon检验;计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验,生存分析采用Kaplan-Meier法计算,单因素分析采用Log-rank检验,多因素分析采用COX模型。P<0.05有统计学意义。结果:1肝细胞癌组织及相应癌旁组织中mi R-32的相对表达量及比较在50例肝细胞癌及相对应癌旁组织中,有33例(66.0%)癌组织中mi R-32相对于癌旁组织表达量升高,且差异有统计学意义(Z=-2.495,P=0.013);表明mi R-32在肝细胞癌组织中的表达显著高于癌旁组织。2肝细胞癌患者中mi R-32的表达与临床病理特征的关系肝细胞癌患者中mi R-32的异常表达与肿瘤有无转移显著相关(P<0.05),在有转移的患者中mi R-32表达上调的阳性率为(85.0%),无转移的患者mi R-32的表达上调的阳性率为(53.3%),其差别具有统计学意义(P=0.021);但mi R-32的异常表达与年龄(P=0.118)、性别(P=1)、肿瘤大小(P=0.321)、AFP值(P=0.924)、肿瘤个数(P=0.858)、Child-Pugh分级(P=1)、表面抗原(P=0.117)、临床分期(P=0.058)之间的差别无明显相关性。3 mi R-32的表达状态与肝细胞癌患者生存期预后的关系Kaplan-Meier法分析显示mi R-32上调表达的肝细胞癌患者的1年、2年、3年生存率分别为61.1%、44.1%、27.2%,中位生存时间为16.0个月,平均生存时间为23.7±3.1个月;下调患者的1年、2年、3年生存率为76.5%、58.8%、41.2%,中位生存时间为31.0个月,平均生存时间为32.2±4.7个月,差异无统计学意义(P=0.109)。肿瘤直径>5cm患者的1年、2年、3年生存率分别为61.6%、39.2%、22.4%,中位生存时间为14.0个月,平均生存时间为22.4±2.7个月;肿瘤直径<5cm患者的1年、2年、3年生存率分别为82.5%、73.3%、64.2%,中位生存时间为46.0个月,平均生存时间为40.2±5.2个月;两者之间的差异有统计学意义(P=0.010)。Child-Pugh分级为A级患者的1年、2年、3年生存率分别为69.3%、51.4%、33.6%,中位生存时间为25.0个月,平均生存时间为27.7±2.8个月;Child-Pugh分级为B级的患者的1、2、3年生存率均为0%,中位生存时间为8.0个月,平均生存时间为8.5±0.5个月,两者之间差异有统计学意义(P=0.035)。有转移患者的1、2、3年生存率分别为48.0%、32.0%、21.3%,中位生存时间为12.0个月,平均生存时间为18.9±3.4个月;无转移患者的1、2、3年生存率分别为79.0%、61.0%、39.5%,中位生存时间为33.0个月,平均生存时间为32.1±3.5个月,两者之间的差异有统计学意义(P=0.018)。为分析与肝细胞癌患者总生存期有关的独立预后因素,将单因素分析中差异有统计学意义组即选择Child-Pugh分级、肿瘤大小、有无转移3个变量进行COX多因素分析,结果显示肿瘤大小是预测肝细胞癌患者术后生存期预后的独立因素(P=0.043),其余参数P值均大于0.05,不能成为预测肝细胞癌患者术后生存期预后的独立因素。结论:1 mi R-32在肝细胞癌组织中较相应癌旁组织中表达上调,说明mi R-32可能参与了肝细胞癌的发生、发展。2 mi R-32的表达状态与肝细胞癌患者有无转移有关,说明mi R-32的异常表达在一定程度上可能反应了肝细胞癌患者的病情。3尚不能认为mi R-32的表达状态为肝细胞癌患者预后判断指标,肿瘤大小可作为预测术后肝细胞癌患者生存期预后的独立因子。