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抗生素在农业、畜牧业和临床方面的过度使用,导致大量耐药细菌的产生,这对药物的选择造成巨大压力。为了应对细菌耐药这一世界性难题,需要对细菌耐药之靶酶的特性进行全面和深入的了解,以指导酶抑制剂的设计与合成,并与临床上的抗生素协同作用来对抗耐药细菌。另外,应积极探索和寻找对抗耐药细菌的新策略和方法。基于这一理念,本研究从事了以下工作：1.基于质粒pMSZ02,发展了一种简单有效的纯化B1亚组金属β-内酰胺酶CcrA(来自于脆弱拟杆菌)的盐析纯化方法。通过向培养基中加入硫酸铵,可以使大部分细菌分泌到培养基的表达产物金属β-内酰胺酶CcrA沉淀出来,并通过Q-Sepharose阴离子交换树脂纯化,得到20mg每升培养液纯的金属β-内酰胺酶CcrA。研究硫酸铵饱和度和目标蛋白沉淀量的关系表明,80%的硫酸铵可以使几乎所有的蛋白沉淀出来。通过该方法纯化得到的CcrA的稳态动力学研究表明,CcrA催化水解青霉素和先锋霉素的动力学常数Km值分别为68±2和17±2μM,kcat值分别63±1和102±3s-1。稳态动力学结果表明,盐析纯化方法可用于分泌性蛋白的纯化过程。2.VanX是万古霉素耐药细菌中的一种必须的金属酶。通过质粒pIADL14,我们成功的表达和纯化了VanX。并对其进行了飞行时间质谱和稳态动力学的表征。结果表明,VanX的分子量为23539.16Da,动力学参数为Km值为0.52±0.05mM,kcat值为6.19±0.14s-1。应用酶动力学方法,用VanX评价了12个D-丙氨酰-D-丙氨酸的磷酰胺类和磷酸酯类酶抑制剂,结果表明,磷酰胺类化合物1a和磷酸酯类化合物2a对VanX的抑制活性最高,其ICso值分别为0.39±0.02和0.48±0.02mM。磷酰胺类化合物1a和磷酸酯类化合物2a和去甲万古霉素协同作用,使得金黄色葡萄球菌的MIC值分别降低8倍和4倍,MRSA2的MIC值均降低1倍。采用微量热法对VanX催化D-丙氨酰-D-丙氨酸的水解过程进行了表征,获得的热力学数据表明,VanX催化水解D-丙氨酰-D-丙氨酸反应在293.15-308.15K范围内是一个自发放热反应。3.为了将光敏剂富集在革兰氏阳性耐药菌细胞壁上,用于光动力学灭活耐药细菌及荧光标记耐药细菌,我们构建了两种新型荧光万古霉素分子,即去甲万古霉素-罗丹明B和万古霉素-赤藓红,对其进行了紫外、荧光和飞行时间质谱的表征。光动力学灭菌研究表明,9μM的去甲万古霉素-罗丹明B在光照3分钟后能对枯草杆菌、耐万古霉素粪肠球菌和临床分离的VRE分别具有71%、54%和47%的灭活率,而万古霉素-赤藓红对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的光动力学灭活率达99.99%以上。浓度为5μM和20μM的去甲万古霉素-罗丹明B可分别对枯草杆菌和耐万古霉素粪肠球菌进行荧光标记,但无法标记大肠埃希菌。4.通过一步反应在赤藓红分子的2位引入N-羟基琥珀酰亚胺酯,合成得到荧光探针赤藓红琥珀酰亚胺酯,并对其进行了紫外吸收光谱和荧光发射光谱的表征。光动力学研究结果表明,赤藓红琥珀酰亚胺酯对人肝癌HepG2细胞的光动力学灭活率比赤藓红略高。而荧光成像结果表明,赤藓红主要分布在人肝癌HepG2细胞的胞浆内,在细胞核内未明显观察到赤藓红的分布。而赤藓红琥珀酰亚胺酯在细胞质和细胞核中均有分布,表明赤藓红琥珀酰亚胺酯既可对细胞质也可对细胞核进行染色。