【摘 要】
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研究目的扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）是一种以心室扩大,伴有心功能减退为主要特征的一种心肌疾病,预后差。抗纤益心方是导师王振涛教授治疗DCM的经验方,临床疗效颇佳,但其具体作用机制有待进一步探讨。本课题组前期研究显示,抗纤益心方改善DCM患者心室重构的机制可能与调节心肌细胞内钙离子的转运相关。本研究为深入探讨抗纤益心方的潜在作用机制,在体实验通过c Tn TR
【基金项目】
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河南省中医药科学研究专项课题-抗纤益心方通过调节内质网-线粒体结构偶联促进扩张型心肌病小鼠心室逆重构的机制研究（项目批准号:20-21ZY2009）；
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研究目的扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）是一种以心室扩大,伴有心功能减退为主要特征的一种心肌疾病,预后差。抗纤益心方是导师王振涛教授治疗DCM的经验方,临床疗效颇佳,但其具体作用机制有待进一步探讨。本课题组前期研究显示,抗纤益心方改善DCM患者心室重构的机制可能与调节心肌细胞内钙离子的转运相关。本研究为深入探讨抗纤益心方的潜在作用机制,在体实验通过c Tn TR141W转基因DCM小鼠模型,观察抗纤益心方对DCM小鼠心室重构和心肌组织IP3R-GRP75-VDAC1钙调节轴的影响。离体实验采用去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）诱导的H9c2心肌细胞肥大模型,观察抗纤益心方对其IP3R-GRP75-VDAC1钙调节轴及细胞凋亡的影响。揭示抗纤益心方抑制DCM心室重构的作用机制,为抗纤益心方的临床应用提供一定的理论依据。研究方法1.在体实验:将30只3月龄,体重28±2g的雄性c Tn TR141W转基因DCM小鼠分为模型组、抗纤益心方组、卡托普利组,将10只同月龄野生C57BL/6J小鼠设为空白对照组。干预时间为8周。1)小动物心脏超声仪检测各组小鼠心脏左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、射血分数（LVEF）、缩短分数（FS）。2)苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE染色）及Masson染色观察各组心肌组织病理形态改变及纤维化情况3)Western Blot检测各组小鼠心肌组织中钙调节通路相关蛋白IP3R、GRP75、VDAC1以及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平。2.离体实验:研究抗纤益心方抑制NE诱导的H9c2细胞凋亡与IP3R-GRP75-VDAC1钙调节轴的关系。采用NE诱导H9C2细胞建立心肌细胞肥大模型,设置正常组、模型组（NE）、中药组（NE+抗纤益心方）、西药组（NE+卡托普利）。检测各组细胞ATP水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Rhod-2钙离子检测各组细胞线粒体内钙离子浓度;q-PCR、Western Blot检测各组细胞中IP3R、GRP75、VDAC1、Caspase-3 m RNA和蛋白表达。研究结果1.小鼠心脏超声结果示:与正常组比较,模型组DCM小鼠的LVESD和LVEDD增大（P＜0.05）,FS和LVEF减小（P＜0.05）;而经抗纤益心方灌胃干预8周后的DCM小鼠LVESD和LVEDD较模型组有所降低（P＜0.05）,且FS和LVEF较模型组升高（P＜0.05）。2.心肌组织HE和Masson染色结果:与正常组比较,模型组心肌细胞核排列紊乱,部分细胞核发生固缩,肌纤维排列不规则,伴有胶原沉积与局部纤维化;抗纤益心方干预后,细胞核与肌纤维排列较整齐,心肌纤维化程度减轻。3.透射电子显微镜下显示抗纤益心方组小鼠心肌超微结构损伤较模型组减轻,线粒体排列整齐,数量较多,形态完整规则,具有相似的大小和丰度。4.Western blot结果显示模型组小鼠心肌组织中钙调节轴的关键蛋白IP3R、GRP75、VDAC1以及凋亡因子Caspase-3的表达量均较正常组被上调（P＜0.05）。而抗纤益心方可以下调DCM小鼠心肌组织中IP3R、GRP75、VDAC1的表达,同时降低Caspase-3的表达（P＜0.05）。5.使用NE诱导构建H9c2心肌细胞肥大模型进行后续实验。Rhod-2 AM钙离子探针染色显示抗纤益心方可以降低NE诱导的H9C2心肌细胞线粒体内钙离子浓度,流式细胞术提示抗纤益心方能有效抑制NE引起的H9C2心肌细胞的凋亡,且抗纤益心方组线粒体膜电位及ATP水平较模型组有所降低（P＜0.05）。在蛋白和m RNA水平上,抗纤益心方组与模型组相比,IP3R、GRP75、VDAC1以及Caspase-3的表达被下调,差异有统计学意义（P＜0.05）。研究结论抗纤益心方抑制扩张型心肌病心室重构的作用可能与调控IP3R-GRP75-VDAC1钙调节轴介导的细胞凋亡相关。
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