Indian hedgehog(Ihh)蛋白是Hedgehog分泌蛋白家族中重要的一员,对胚胎期和出生后的软骨形成和发育起着重要的调控作用。在自然条件下,翻译后的Ihh蛋白前体(46k D)会发生分子内裂解反应,形成高度保守的20k D左右的信号功能域Ihh N和26k D的羧基端蛋白域Ihh C.这个过程中,Ihh N蛋白的羧基端被胆固醇修饰(Ihh Np),随后氨基端被棕榈酸修饰,两个脂修饰对于Ihh蛋白在细胞膜上的定位、多聚体形成和信号活性具有重要影响。经过加工和修饰的Ihh Np蛋白以多聚体的形式(s-Ihh Np)扩散到达靶细胞,并与受体patched结合,将信号进一步传递。Hedgehog家族中与Ihh结构相似的另外两个蛋白分别是Sonic hedgehog(Shh)和Desert hedgehog(Dhh),它们在氨基酸序列上具有高度的保守性,如果只计算N端信号功能序列同源性,则更是高达80%。由于Hh N是主要执行信号功能的蛋白,因此目前研究较多,主要包括Hh N蛋白的脂修饰,氨基端保守区域的功能研究,蛋白质结构分析以及多聚体和蛋白分泌的研究。我们注意到,大家对于Hh N蛋白羧基端的关注比较少。而该区域靠近Hh蛋白自裂解和胆固醇修饰的位点,在不同物种中具有高度的保守性。这提示我们,Hh N蛋白高度保守的羧基端有可能具有重要的生物学功能。为了了解Ihh N蛋白羧基端保守区域的作用,我们首先构建了Ihh N蛋白羧基端区域不同截断体的表达载体,当删除该区域SAAAKT六个氨基酸时,N端蛋白的稳定性受到影响;删除十个氨基酸(KSEHSAAAKT)时,蛋白不能发生自裂解。在此基础上,我们进一步构建了这一区域的不同点突变载体,蛋白表达实验发现该区域T200氨基酸突变后Ihh N蛋白的稳定性降低。更重要的是,我们发现由K191,S192,E193和H194四个氨基酸共同组成的结构域对于蛋白的自裂解有重要影响。接下来,我们在Shh蛋白羧基端与Ihh蛋白KSEH相同位置进行了同样的截断体试验,结果也发现这个结构域影响了Shh蛋白的自裂解反应。这表明Hh蛋白羧基端的这一区域的功能是高度保守的。以上这些新发现将为进一步深入阐释Hh蛋白自裂解机制提供重要依据。此外,在对Ihh N蛋白晶体结构进行分析时发现,一个Hh N蛋白的羧基端至少有三个氨基酸S195,A196和A197插入了相邻的Hh N蛋白分子的内部,提示我们这三个氨基酸或者以这三个氨基酸为主的某个结构域可能对Ihh蛋白多聚体形成有重要作用。于是,我们筛选了稳定表达Ihh-SAA(删除SAA三个氨基酸)的细胞克隆,通过收集上清中的蛋白来检测S195,A196和A197这三个氨基酸对Ihh蛋白多聚体形成的影响,结果发现Ihh-SAA突变体多聚体形成显著减少,说明SAA三个氨基酸对Ihh蛋白多聚体的形成具有重要作用。总的来说,我们的研究从蛋白质生化性质的角度较为清晰地描述了Ihh N蛋白羧基端对于Ihh蛋白的自裂解加工过程,多聚体的形成以及蛋白稳定性的作用和影响,为进一步揭示Ihh蛋白的生化特性提供了新的证据。