阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)以进行性认知功能障碍和神经元病理性丢失为特征,是当今世界老龄化趋势下出现的主要神经变性疾病之一。与AD病因机制相关的假说较多,如Aβ毒性学说、Tau蛋白假说、炎症机制、自由基损伤学说、胆碱能学说等等,尽管众说纷纭,但Aβ毒性学说仍是目前的主流学说。AD主要是由于Aβ(β-amyloid protein)沉积形成的老年斑与高度磷酸化Tau蛋白聚集形成造成神经纤维缠绕和神经元丢失。在神经变性疾病的相关研究中发现,Aβ以寡聚体或纤维体两种状态存在,这两种状态的Aβ对神经细胞功能损伤的强度不同,一般认为,Aβ寡聚体的毒性较纤维体更强,但由于寡聚体的稳定性较差,易向纤维体转化,体外研究操作时间窗相对较短,所以使用寡聚体进行实验之前,对其进行鉴定就显得尤为重要,否则容易导致试验药物有效的假阳性结果,但目前关于Aβ聚集状态的鉴定方法报道较少。为此,本实验先制备不同聚集状态的Aβ1-42,然后通过原子力显微镜直观比较、鉴定两种Aβ1-42形态。在AD病理过程中,由于Aβ产生和清除的动态失衡,过多的Aβ聚集沉积形成老年斑,在AD老年斑周围聚集了大量活化的小胶质细胞,Aβ可促进小胶质细胞产生如TNF-α、IL-1β等炎症因子,从而对神经元在内的各种细胞造成损失甚至凋亡,本实验通过体外建立AD小胶质细胞模型,为AD的炎性机制研究提供体外实验依据。已有研究发现,补体系统在阿尔茨海默病的炎性发病机制中发挥重要作用。Aβ、小胶质细胞、星形细胞及异常上调表达的补体和细胞因子共同形成了复杂的炎性损伤网络,引起一系列炎症反应,最终导致神经细胞凋亡,补体系统介导的损害是Aβ细胞毒性作用机制中的重要环节之一,Aβ与经典补体激活通路的Clq发生特异性结合,C1q经Aβ的激活而活化,活化的Clq随之活化C3、C4、C5因子,并使补体裂解生成多种生物活性片段,包括C3a、C4a、C5a,最终形成膜攻击复合物(MAC,C5b-9复合体),具有神经毒性的MAC可直接溶解神经元,在AD脑内造成神经元凋亡。其中,补体系统的C5a在AD致病过程中的作用不详,最近研究发现,在C3基因敲除(C3-/-)小鼠中,IgG免疫复合物依然能够对小鼠产生C5a依赖的急性肺损伤,且损伤强度与野生型小鼠(C3+/+)的作用相当,这说明C5a的产生可以是非C3依赖性的,这是一条崭新的补体激活途径,同时提示,C5a的产生同样会产生类似补体系统经传统途径激活后所导致的炎症损伤作用。C5a可吸引表达C5a受体的小胶质细胞和星形胶质细胞向活化部位聚集,然后与Aβ发挥协同作用,刺激胶质细胞产生细胞因子、趋化因子、黏附分子等,也可直接与小胶质细胞结合诱发氧化应激反应,导致邻近的神经细胞损伤或死亡。因此,本研究将验证补体C5a对AD小胶质细胞激活、炎性介质释放的可能作用及其机制,并进一步明确C5a受体拮抗剂PMX205对上述病变过程的干预作用。[目的]建立A β1-42寡聚体和纤维体的制备及其鉴定方法,利用Aβ1-42寡聚体刺激小胶质细胞建立阿尔茨海默病(AD)小胶质细胞病变模型；在此基础上,探讨补体C5a对AD小胶质细胞模型释放炎性因子的作用及其机制,明确C5a受体拮抗剂对上述病变过程的干预作用。[材料和方法]1材料：小鼠BV2小胶质细胞株购自武汉大学的中国典型培养物保藏中心,澳洲胎牛血清(GIBCO),DMEM/F12高糖培养基(GIBCO),胰酶(含EDTA,0.25%,吉泰生化公司),人工合成的生物晶体Aβ1-42(ENZO公司),六氟异丙醇(HFIP,Sigma),二甲基亚砜(DMSO,MP Biomedicats),补体C5a(HBT公司),C5a受体拮抗剂(PMX205) hydrocinnamate-[OP(D-Cha)WR](上海吉尔生化有限公司合成),PE标记的抗小鼠CD88流式抗体(Bio legend公司),小鼠TNF-a ELLSA试剂盒(Bio legend公司),CCK-8试剂盒(日本同仁公司)。仪器：超净工作台(中国,AIRTECH),细胞培养箱(美国,Thermo Foma)、倒置显微镜(日本,OLYMAPUS)、流式细胞分析仪(德国,Becton Dickinson),低温高速离心机(德国,Beckman), SynerTM HT多通道酶标仪(美国,BIOTEK),原子力显微镜(本原纳米仪器公司,型号CSPM5500)。2方法：2.1BV-2细胞培养将BV-2细胞株接种到含10%胎牛血清、高糖DMEM培养基中培养,置于37。℃、5%C02培养箱中孵育,每3天传代一次,用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化。2.2设定不同的环境条件将A β1-42单体分别聚集成寡聚体和纤维体两种状态将lmg Aβ1-42粉末溶于冷却的六氟异丙醇(HFIP)220μL中,室温孵育60分钟使Aβ1-42充分溶解,将Aβ肽-HFIP放置在冰上5～10分钟后移至通风橱内,打开瓶盖以便HFIP挥发。风干后形成透明的Aβ肽膜,溶解于44μL新鲜无水100%DMSO制成5mmol/LA β1-42合成肽,用无含酚红的F12培养液稀释成终浓度50nmol/L,4℃孵育24小时后,以4℃,14000r/min离心10分钟,取上清液即为Aβ1-42寡聚体,放置在-80℃保存。将5mmol/L Aβ1-42-DMSO合成肽用10mmo/L盐酸溶解稀释成终浓度50nmol/L,置于37℃温箱孵育24小时即为Aβ1-42纤维体,放置在-80℃保存。2.3利用原子力显微镜鉴定Aβ1-42的不同聚集状态。原子力显微镜鉴定方法：将A β1-42制成品滴于新鲜解离的云母片上,室温下静置5分钟后用去离子水轻柔冲洗,干燥皿中干燥10分钟后放置在原子力显微镜下观察,先用接触模式扫描到云母片上的生物制品,再改用轻敲模式进行扫描。轻敲模式参数：力常数40N/m,共振频率300kHz,扫描频率1Hz。图像处理软件为Imager4.60。2.4利用CCK-8法比较A β1-42寡聚体与纤维体对BV-2细胞存活率的影响。以细胞密度为105/ml的BV-2小胶质细胞接种于96孔板,加入无血清DMEM/F12高糖培养基培养24小时,然后分别加入不同浓度(0.01um/L,0.1um/L, lum/L,10um/L) Aβ42寡聚体和纤维体,共同作用24小时后吸除上清液,每孔加入180ul培养基L+20ul CCK-8试剂避光共同孵育,待2小时后通过酶标仪测定450nm波长处OD值。重复3次。2.5用Aβl-42寡聚体刺激BV-2小胶质细胞建立AD小胶质细胞病变模型。实验组分为Aβ1-42干预组、Aβ1-42+C5a组、Aβ1-42+C5aRA组、Aβ1-42+C5a+C5aRA组,分别加入不同浓度的C5a、C5aRA、 C5a+C5aRA进行干预,以BV-2小胶质细胞无干预组为空白对照。2.6ELISA法检测细胞上清中TNF-a水平经不同干预处理24小时后,取细胞上清液,按照试剂盒说明书进行ELISA检测上清液中TNF-a含量,波长设定为450nm,以96孔酶标仪检测吸光度值,通过标准品对数曲线计算出TNF-a含量。2.7流式细胞术检测细胞表面CD88表达经处理24小时后,将不同处理组细胞消化、重悬成单细胞悬液,每组细胞加入PE标记的抗小鼠CD88抗体进行染色,4℃孵育30分钟,用PBS清洗细胞3次,流式细胞仪检测CD88表达。3统计学处理应用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理,实验结果以x±sd表示,BV-2细胞经同一浓度水平、不同状态的Aβ1-42干预后的存活率比较方法采用独立样本t检验,补体C5a干预实验中两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较先采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),如有统计学意义差别时,再采用LSD法进行两两比较,以P<0.05为有效统计学差异水平。[结果]1在原子力显微镜下,Aβ1-42寡聚体呈球状或椭圆球状颗粒,高度为5nm左右,而Aβ1-42纤维体在镜下则呈现长条纤维状聚集,高度约为3nm左右,长度>1000nm。2CCK8法显示无论Aβ1-42寡聚体和纤维体均对BV-2细胞具有损伤作用,并且成剂量-效应关系,同时,在同样浓度水平的条件下,自0.1um/L浓度起,寡聚体的毒性作用均比纤维体更显著(所有P值均小于0.05)3Aβl-42寡聚体能刺激BV-2小胶质细胞分泌TNF-a,Aβ1-42组TNF-a浓度与空白对照组相比明显增加(t=16.60,P<0.05),该组CD88表达高于空白对照组(t=4.81,P<0.01)；Aβ1-42+C5a组的TNF-a浓度高于单纯Aβl-42组(F=24.50,P<0.05),Aβ1-42+C5aRA组TNF-α浓度低于单纯Aβ1-42组(F=280.12,P<0.01),发现50nmol/L C5aRA可显著抑制5nmol/L C5a对AD小胶质细胞TNF-α的释放作用(t=28.06,P<0.01),100nmol/L C5aRA可显著抑制10nmol/L C5a对AD小胶质细胞TNF-a的释放作用(t=5.73,P<0.01)。而Aβ1-42+C5a组及Aβ1-42+C5aRA组的CD88表达与单纯Aβ1-42组相比无显著差异(P>0.05)。[结论]原子力显微镜可直观地观察到Aβ1-42的不同聚集状态,是鉴别A B1-42寡聚体与纤维体的简便、直观的方法,Aβ2-42寡聚体比纤维体更具细胞毒性；C5a能刺激小胶质细胞分泌炎症因子TNF-a,且与Aβ1-42有协同作用,而C5aRA则能有效抑制该致病通路。