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昆虫几丁质酶属于18家族的糖苷水解酶,它们参与昆虫不同发育阶段的各种重要生理过程,如蜕皮、围食膜的降解、免疫防御、细胞增殖、消化和生长因子等。至今,已将昆虫几丁质酶至少分为十个（Ⅰ-Ⅹ）类型（Group）,其中,IV型几丁质酶主要在中肠或脂肪体中表达。分布于中肠的几丁质酶主要降解围食膜中的几丁质成分。由于Ⅳ型几丁质酶参与昆虫围食膜更新,且围食膜是昆虫的第一道防线,因此,Ⅳ型几丁质酶可作为害虫防治的靶标。在本研究中,从农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）的中肠中克隆了Ⅳ型几丁质酶基因HaCHT4,对其进行生物信息学分析并命名为HaCHT4,q PCR分析该基因的表达规律,原核表达和纯化融合蛋白His-HaCHT4以及制备其多克隆抗体,并研究了His-HaCHT4的酶学性质。在大肠杆菌HT115（DE3）中表达针对于HaCHT4的ds RNA,经琼脂糖凝胶电泳和Northern blot鉴定表达的ds RNA,之后将表达ds RNA的工程菌饲喂棉铃虫幼虫后,分别用q PCR和免疫组化分析靶基因在核酸和蛋白水平上的沉默情况,最后测定HaCHT4沉默对幼虫生长发育的影响。主要结果如下:1.棉铃虫IV型几丁质酶基因的克隆、生物信息学分析、表达规律以及蜕皮前后围食膜几丁质含量的测定根据其他昆虫IV型几丁质酶的保守序列设计简并引物,PCR扩增核心片段并测序。运用RACE技术获得几丁质酶c DNA的5’和3’端缺失的序列。克隆的棉铃虫几丁质酶c DNA长度为1695 bp（Genbank登录号:MH500771）,在5’（104bp）和3’（61 bp）末端两个非翻译区（UTR）。ORF序列编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 k Da,预测的等电点（p I）为4.37,该多肽在N端具有29氨基酸的信号肽序列,在31-380的氨基酸处具有几丁质酶的催化结构域（catalytic domain,CAD）和C端的452-509处具有几丁质结合结构域（chitin binding domain,CBD）（图1）。预测的两个糖基化位点位于N445,N447,预测磷酸化位点共38个。其蛋白序列中的苏氨酸（9.8%）,丝氨酸（8.6%）和丙氨酸（8.4%）含量较高。将该几丁质酶的氨基酸序列与Gen Bank中的其他几丁质酶进行Blast,并进行多序列分析,将获得酶命名为几丁质酶4（chitinase 4）,即HaCHT4,系统发育树分析后分为Ⅳ型几丁质酶。q PCR检测结果表明,HaCHT4在棉铃虫1-6龄幼虫期以及预蛹期都有表达,在2龄幼虫期的表达量最高（P＜0.001）,其次是1龄幼虫期（P＜0.001）,1龄幼虫和2龄幼虫中的表达量分别是预蛹期的100.7和200.9倍。3龄幼虫到预蛹的表达水平显著低于1龄幼虫和2龄幼虫期（P＜0.001）。相反,3-6龄幼虫和预蛹之间没有显著差异（P＞0.05）。HaCHT4在6龄幼虫的中肠和脂肪体中表达量较高,分别是体壁中表达量的25.1和40.6倍（P＜0.05）。q PCR分析了HaCHT4在每个龄期蜕皮前后的中肠中的表达量,结果显示,每个龄期蜕皮前的表达量高于蜕皮后的表达量,即4龄蜕皮前的表达量极显著高于4龄蜕皮后表达量（P＜0.0001）,5龄蜕皮前的表达量显著高于5龄蜕皮后表达量（P＜0.05）,6龄蜕皮前的表达量极显著高于6龄蜕皮后表达量（P＜0.001）,6龄末期的表达量极显著高于预蛹（P＜0.0001）。提取了棉铃虫蜕皮前后围食膜的几丁质并测定其含量,结果表明,4龄和6龄蜕皮前围食膜的几丁质含量显著低于蜕皮后（P＜0.05）,6末期后几丁质含量有下降趋势,但与6龄蜕皮后相比无统计学上的差异。2.棉铃虫HaCHT4的异源表达、纯化、酶学性质及多克隆抗体的制备HaCHT4的ORF与表达载体p ET32a连接并转化至大肠杆菌（DE3）中,阳性克隆双酶切鉴定和测序正确。IPTG成功诱导表达融合蛋白His-HaCHT4（理论大小为70.1 k D）。利用Western blot进一步验证的His-HaCHT4为正确。浓度梯度洗脱法纯化融合蛋白,蛋白纯化检测显示,20、120、200 mmol/L的咪唑溶液可以洗脱非目的蛋白,当咪唑浓度为500 mmol/L时,能洗脱单一的融合蛋白。用Western blot鉴定纯化的His-HaCHT4,结果表明杂交出大小与预计相符合的条带。还进行了融合蛋白的酶活测定和酶学性质,与对照（缓冲液）相比,His-HaCHT4有显著的降解活性（P＜0.0001）,即酶活为0.0217±0.0057μg/m L·s,表明融合蛋白His-HaCHT4能降解几丁质。根据双倒数作图法计算的动力学参数Km值和Vmax分别为1.76±0.35 mg/m L和0.0220±0.0012μg/m L·s。重组蛋白His-HaCHT4在较宽的p H范围内都有活性,从p H 5～10范围内具高活性,并最适p H约为7;在最适温度反应中,相对活性随着温度升高而增加,并约在50℃时达到峰值,随后下降。以纯化的融合蛋白His-HaCHT4作为抗原射免疫小鼠。4次免疫后,ELISA检测的抗His-HaCHT4多克隆抗体的滴度高于1∶204 800。Western blot法检测的免疫特异性结果显示,该抗体能与His-HaCHT4及棉铃虫体中的天然HaCHT4结合,但不能与黄粉虫的蛋白结合。表明制备的抗His-HaCHT4的多克隆抗体对棉铃虫体内的HaCHT4具有较好的结合特异性,可以用于后续的研究。3.HaCHT4的RNAi及其幼虫生长发育的影响将HaCHT4的ORF序列分成三个片段,即包含几丁质酶的保守区（P1）、不包含保守区（P2）,包含几丁质酶结合结构区（P3）,并构建针对于HaCHT4的干扰片段P1（L4440-P1）、P2（L4440-P2）和P3（L4440-P3）的表达载体,IPTG诱导表达后,提取大肠杆菌总RNA,琼脂糖电泳检测结果表明,重组菌体能正确表达针对HaCHT4的ds RNA,分别合成针对于P1\P2\P3的探针,Northern blot进一步检测表达的ds RNA正确。用能表达ds P1、ds P2、ds P3、和dsw（无关基因）的工程菌饲喂棉铃虫2龄幼虫后,提取棉铃虫中肠的RNA,检测HaCHT4的m RNA含量。结果显示,菌液饲喂48 h后,ds P1和ds P3的菌液都能显著降低HaCHT4的m RNA含量（P＜0.05）。饲喂72 h后,只有ds P2片段能显著降低HaCHT4的m RNA的含量（P＜0.05）。饲喂96 h后,ds P1和ds P2片段能显著降低HaCHT4的m RNA含量（P＜0.05）。饲喂120 h天后,ds P2和ds P3片段能显著降低HaCHT4的m RNA含量（P＜0.05）。只有ds P2对棉铃虫中肠HaCHT4有明显的干扰作用,ds P2的沉默效应随着时间的延长而降低。综合分析后,筛选最优干扰片段ds P2进行后续的研究。通过免疫组化对靶基因在蛋白水平的表达进行了检测,饲喂48 h、72h、96 h、120 h后,与对照dsw组相比,靶蛋白的表达量明显降低。饲喂96 h后的发现肠壁变薄的现象。用表达ds P2、和dsw的相应的工程菌饲喂棉铃虫2龄幼虫,饲喂72 h,120 h和120 h测定体重、体长,对照相比,表达ds P2工程菌能显著减轻幼虫的体重、体长。