目的:参苓白术散是临床常用治疗脾气虚证的健脾方,与肠道菌群和肠道产短链脂肪酸菌群有着密切联系,目前研究大多从中药复方角度探究对肠道菌群的调节作用,但其药理机制尚不明确。基于中药多糖是复方中的重要有效成分,肠道菌群及肠道功能菌群是健脾方的重要靶点,本研究以肠道产短链脂肪酸菌群为对象,通过构建脾气虚证动物模型并治疗,结合体外碳源实验,旨在通过研究参苓白术散多糖调节肠道产短链脂肪酸菌群,进一步探究参苓白术散多糖发挥健脾作用的微生态机制。方法:1.分组及模型构建:将SD大鼠随机分为空白组（B组）、脾气虚证模型组（SQ组）、参苓白术散多糖组（PH组）、参苓白术散汤剂组（D组）和蔗糖组（SUC组）（n=6）。造模阶段（第1-14天）对除B组外的所有大鼠进行“苦寒泻下+劳倦过度+饮食失节”造模法建立脾气虚证模型,B组灌胃生理盐水;治疗阶段（第15-28天）对PH组、D组、SUC组分别给以参苓白术散多糖、参苓白术散汤剂和蔗糖治疗,B组和SQ组予以生理盐水。记录大鼠体重、粪便性状、精神状态、饮食量、毛发情况等体征。治疗结束后采集大鼠脾脏和胸腺并称重计算脏器指数;采集尿液、血液和结肠组织,通过采用D-木糖试剂盒测定每组大鼠尿D-木糖排泄率,用ELISA法测定每组大鼠血清CPK活性,观察脾气虚证大鼠的骨骼肌受损情况,用H.E.染色法观察大鼠结肠组织改变,为后续微生态实验建立成功的脾气虚证动物模型。2.治疗过程中肠道总菌群的结构变化:采集大鼠粪便并提取DNA用Illumina Mi Seq测序平台检测每组大鼠在正常阶段、造模阶段和治疗阶段肠道总菌群的变化,观察参苓白术散多糖治疗脾气虚证对肠道总菌群的影响。3.治疗过程中肠道产短链脂肪酸菌群的结构变化:使用丁酰辅酶A-辅酶A转移酶基因对粪便DNA进行PCR扩增,后再采用TA cloning测序平台检测每组大鼠各个阶段肠道产丁酸菌群多样性与结构变化;使用mmd A、lcd A、pdu P、pdu Q基因对粪便DNA进行PCR扩增,再用TA cloning测序平台检测大鼠在各个阶段肠道产丙酸菌群多样性与结构变化,研究参苓白术散多糖对肠道产丁酸菌群和产丙酸菌群的影响;测定治疗阶段大鼠的粪便短链脂肪酸含量,研究参苓白术散多糖对脾气虚证大鼠肠道产短链脂肪酸水平的影响;4.体外碳源实验:通过混合菌丁酸梭菌和厚壁菌YT2在BHI培养基和参苓白术散多糖为唯一碳源培养基中培养,每2-4h取一次样,测定混合菌在不同培养基中的生长数量和产丁酸浓度,研究参苓白术散多糖对肠道产丁酸菌体外生长的影响。结果:1.脾气虚证模型构建结果:通过“苦寒泻下+劳倦过度+饮食失节”法建立脾气虚证大鼠,造模组（SQ组、PH组、D组、SUC组）大鼠出现精神倦怠、泄泻、饮食减少等表现,体重增长速度较B组缓慢（P＜0.05）,其中SQ组大鼠脾脏指数、尿D-木糖排泄率和CPK活性显著低于B组（P＜0.05）,胸腺指数较B组无显著性差异（P＜0.05）;SQ组大鼠可见肌层、粘膜层、粘膜下层有明显炎细胞浸润;根据大鼠一般体征表现、相关生化指标结果和结肠组织切片染色结果表明,脾气虚证模型构建成功。2.治疗脾气虚证大鼠肠道总菌群变化结果:采用Illumina Mi Seq（PE300）测序平台进行测序,5组90个样本共计得到分类单元个数:界（Kingdom）:1;门（Phylum）:11;纲（Class）:18;目（Order）:49;科（Family）:90;属（Genus）:201;种（Species）:376;OTU:1179。（1）F/B比值变化:B组各阶段F/B值无明显变化;造模后,SQ组（20.83%）F/B值与PH组（20.29%）、D组（37.50%）和SUC组（30.14%）比较,与本组正常阶段差异更大（P＜0.05）;治疗后,PH组（155.88%）F/B值比D组（89.13%）和SUC组（62.07%）更接近于本组正常阶段（P＜0.05）,提示参苓白术散多糖能恢复脾气虚证大鼠肠道主要菌群比,恢复程度优于参苓白术散汤剂和蔗糖。（2）α多样性变化:B组三阶段比较,物种丰度和多样性均无显著性差异（P＞0.05）;SQ组:SQ2与SQ1相比,SQ2 Ace指数（315.77±54.25）、Chao指数（309.25±45.55）、OTU数目（234）、Shannon指数（3.84±0.23）均下降,Simpson指数（0.07±0.02）升高,SQ组造模阶段物种丰度下降（P＜0.001）,多样性下降（P＜0.05）,SQ3与SQ2相比,SQ3 Ace指数（386.56±81.17）、Chao指数（372.27±61.59）、OTU数目（308）、Shannon指数（3.35±0.47）均升高,Simpson指数（0.10±0.07）下降,可知SQ组治疗阶段物种丰度增加（P＞0.05）,多样性增加（P＜0.01）;PH组:PH2与PH1相比,PH2 Ace指数（312.33±55.74）、Chao指数（299.34±44.18）、OTU数目（228）、Shannon指数（2.72±0.47）均下降,Simpson指数（0.17±0.09）升高,PH组造模阶段物种丰度下降（P＜0.001）,多样性下降（P＜0.05）,PH3与PH2相比,PH3 Ace指数（495.08±32.08）、Chao指数（501.49±32.21）、OTU数目（380）、Shannon指数（3.71±0.38）均升高,Simpson指数（0.08±0.03）下降,可知PH组治疗阶段物种丰度增加（P＜0.001）,多样性增加（P＜0.05）;D组:D2与D1相比,D2 Ace指数（336.2±91.33）、Chao指数（315.66±68.18）、OTU数目（244）、Shannon指数（2.74±0.46）均下降,Simpson指数（0.08±0.15）升高,D组造模阶段物种丰度下降（P＜0.001）,多样性下降（P＜0.05）,D3与D2相比,D3 Ace指数（421.10±70.54）、Chao指数（420.87±74.8）、OTU数目（335）、Shannon指数（3.16±0.51）均升高,Simpson指数（0.15±0.08）下降,可知D组治疗阶段物种丰度和多样性增加（P＞0.05）;SUC组:SUC2与SUC1相比,SUC2 Ace指数（301.86±63.25）、Chao指数（286.09±62.75）、OTU数目（222）、Shannon指数（2.51±0.17）均下降,Simpson指数（0.19±0.06）升高,SUC组造模阶段物种丰度和多样性明显下降（P＜0.001）,SUC3与SUC2相比,SUC3 Ace指数（397.76±21.35）、Chao指数（406.94±33.61）、OTU数目（299）、Shannon指数（3.05±0.37）均升高,Simpson指数（0.13±0.04）下降,可知SUC组治疗阶段物种丰度增加（P＜0.01）,多样性增加（P＞0.05）。（3）β多样性:PCA分析结果显示,SQ组主要物种组成与其余四组差异大;相较于D组和SUC组,PH组与B组距离最近,提示PH组和B组物种组成最相似。可知,参苓白术散多糖能恢复脾气虚证大鼠肠道总菌群物种组成,且恢复程度优于参苓白术散汤剂和蔗糖。（4）门水平主要物种:B组、SQ组、PH组和SUC组三阶段均以Bacteroidetes和Firmicutes为主;D组正常阶段以Bacteroidetes、Firmicutes和Verrucomicrobiota为主,造模阶段和治疗阶段以Bacteroidetes和Firmicutes为主。（5）属水平主要变化物种:B组三阶段均以Muribaculaceae属最多;SQ组正常阶段以Muribaculaceae属丰度最高（36.47%）,造模阶段（14.68%）和治疗阶段（42.40%）以Lactobacillus属丰度最高;PH组Muribaculaceae属在正常阶段（34.33%）和治疗阶段（27.37%）丰度最高,Romboutsia属造模阶段（18.25%）丰度最高;D组Muribaculaceae属在正常阶段（35.12%）和治疗阶段（23.29%）丰度最高,Lachnospiraceae属造模阶段（13.26%）丰度最高;SUC组Muribaculaceae属在正常阶段（35.98%）和治疗阶段（26.40%）丰度最高,Escherichia-Shigella属造模阶段（12.45%）丰度最高。由上可知,参苓白术散多糖能增加脾气虚证大鼠肠道总菌群物种丰度和多样性,主要增加Muribaculaceae属丰度。3.治疗脾气虚证大鼠肠道产丁菌群变化结果:以丁酰辅酶A-辅酶A转移酶基因为分子标记的扩增SQ组、PH组、D组和SUC组均获得300条序列确定为产丁酸菌群多样性结果。SQ组OTU数量,造模阶段（3个）减少至由正常阶段（9个）的33%,治疗阶段（4个）恢复至正常阶段44.44%;PH组OTU数量,造模阶段（4个）减少至由正常阶段（9个）的44.44%,治疗阶段（7个）恢复至正常阶段77.78%;D组,OTU数量,造模阶段（3个）减少至由正常阶段（8个）的37.50%,治疗阶段（5个）恢复至正常阶段62.50%;SUC组OTU数量,造模阶段（4个）减少至由正常阶段（9个）的44.44%,治疗阶段（5个）恢复至正常阶段55.56%。产丁酸菌群均存在于四组大鼠的所有阶段,均为厚壁菌门产丁酸菌。与造模阶段相比,治疗阶段各组脾气虚证大鼠肠道产丁酸菌群属水平主要变化如下:SQ组Clostridium属和Eubacterium属丰度略有降低;PH组Roseburia属丰度明显升高,Clostridium属丰度明显降低;D组Roseburia属和Eubacterium属丰度升高,Clostridium属丰度降低;SUC组Clostridium属丰度升高,Eubacterium属丰度降低。系统发育树显示,所有样本序列可归属于9个Cluster,将参苓白术散多糖治疗脾气虚证大鼠各阶段的簇进行百分比分析可知:PH3产丁酸菌与PH1相比,多样性降低,但与PH2相比,多样性上升,产丁酸菌群结构发生改变。可知,参苓白术散多糖能增加脾气虚证大鼠肠道产丁酸菌群的丰度和多样性,主要增加Roseburia属丰度、减少Clostridium属丰度。4.治疗脾气虚证大鼠肠道产丙酸菌群变化结果:产丙酸菌mmd A、lcd A、pdu P、pdu Q的PCR扩增中只有mmd A基因和pdu P基因扩增成功,以mmd A基因和pdu P基因为分子标记来检测大鼠肠道产丙酸菌的变化情况。通过测序得到:SQ组获得7条序列,PH组PH1、PH2、PH3各获得37、47、21条序列,D组D1、D2、D3各获得50、50、29条序列,SUC组SUC1、SUC2、SUC3各获得97、15、55条序列,所测得序列均确定为产丙酸菌群多样性结果。产丙酸菌群均存在于治疗组大鼠的每个阶段,正常阶段以拟杆菌门产丙酸菌群为主,约占75.54%,建模阶段均为拟杆菌门产丙酸菌群;治疗阶段,拟杆菌门产丙酸菌群约占51.70%,厚壁菌门产丙酸菌群约占48.30%。与造模阶段相比,治疗阶段各组脾气虚证大鼠肠道产丙酸菌群属水平主要变化如下:PH组Barnesiella属和Alistipes属丰度增加;D组Phocaeicola属和Barnesiella属丰度增加;SUC组Blautia属丰度升高,Alistipes属和Bacteroides属丰度降低。系统发育树显示,所有样本序列可归属于8个Cluster,将参苓白术散多糖治疗脾气虚证大鼠各阶段的簇进行百分比分析可知:PH1与PH2相比,产丙酸菌群多样性降低,与PH3相比,多样性无明显变化,产丙酸菌群结构发生改变。5.治疗阶段脾气虚证大鼠肠道短链脂肪酸含量变化结果:8种短链脂肪酸在B组中含量最高的3种为,乙酸（36.79±5.39μg/m L）、丙酸（20.09±0.46μg/m L）、丁酸（25.97±2.26μg/m L）;与B组相比,SQ组乙酸、丙酸、丁酸含量显著降低;各治疗组中乙酸（31.07±4.34μg/m L）、丙酸（18.66±1.97μg/m L）、丁酸（23.48±4.18μg/m L）PH组最高,与SQ组相比显著升高;丁酸在各组含量由高到低依次为:B组（25.97±2.26μg/m L）＞PH组（23.48±4.18μg/m L）＞SUC组（22.96±3.59μg/m L）＞D组（21.90±10.52μg/m L）＞SQ组（20.62±3.13μg/m L）;丙酸在各组平均含量由高到低依次为:B组（20.09±0.46μg/m L）＞PH组（18.66±1.97μg/m L）＞D组（17.37±2.72μg/m L）＞SUC组（16.18±2.98μg/m L）＞SQ组（12.48±5.90μg/m L）。由此可知,参苓白术散多糖能促进脾气虚证大鼠肠道内丁酸和丙酸的产生,有利于恢复肠道微生态平衡。6.体外碳源实验:混合菌丁酸梭菌和厚壁菌YT2在参苓白术散多糖为唯一碳源培养基中细菌生长最大值（（0.97±0.006）×10~9CFU/m L）高于在BHI培养基最大值（（0.87±0.013）×10~9CFU/m L）,参苓白术散多糖能促进混合菌生长数量;混合菌在BHI培养基中第10 h达到生长最大值,参苓白术散多糖为唯一碳源培养基中第36 h达到生长最大值,在BHI培养基中混合菌生长速度快于参苓白术散多糖为唯一碳源培养基;参苓白术散多糖为唯一碳源培养基中产生丁酸的最高浓度（3142.88±28.47μg/m L）高于BHI培养基中产生丁酸的最高浓度（1658.35±31.09μg/m L）,参苓白术散多糖能促进丁酸的产生。参苓白术散多糖调节肠道产丁酸菌群的机制可能是多糖成分先被具有多糖利用位点的厚壁菌YT2先降解为单糖,再由产丁酸菌将单糖分解代谢成丁酸,增加丁酸的产生,供机体吸收利用以达到治疗作用。结论:本文通过脾气虚证动物模型的治疗和体外碳源实验,研究参苓白术散多糖调节脾气虚证的微生态机制。实验发现,参苓白术散能够有效调节脾气虚证大鼠肠道总菌群和肠道产短链脂肪酸菌群（以产丁酸菌群为主）的丰度和多样性,增加益生菌的丰度,其中,参苓白术散多糖不仅具有明显调节菌群的优势,还能促进产丁酸菌的生长,增加丁酸含量。本研究结果提示参苓白术散多糖是调节脾气虚证大鼠肠道菌群最重要的活性成分,可为临床参苓白术散治疗脾气虚证药理提供参考。