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研究背景当前中国心血管疾病的发病率和死亡率持续上升,已高于恶性肿瘤并成为了中国居民的主要致死原因,其中静脉血栓栓塞（venousthromboembolism,VTE）是除冠心病、中风外的第三大致死亡的心血管疾病。目前认为,静脉血栓和动脉血栓形成之间存在着相似的发病机理,凝血和血小板激活过程在动脉和静脉血栓生成时均有重要影响。随着对血小板活化机制的深入研究,人们进一步认识到抗血小板治疗不仅可降低血栓事件复发率,而且是预防血栓的有效途径。现有的抗血小板药物存在出血风险增加等不良后果。因此,寻找安全有效的新型抗血小板药物仍是心血管研究领域的热点话题。GPⅡb/Ⅲa受体是血小板活化的最后途径,研究证实,GPⅡb/Ⅲa的激活受蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase,PDI）的调节,PDI是一种具有催化蛋白质二硫键的酶,可促进血小板聚集、粘附和颗粒释放。因此PDI是一个有潜在开发价值的抗血栓药物研究靶点。血小板表面GPⅡb/Ⅲa的表达受葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulatedprotein 94,GRP94）调节,GRP94在GPⅡb/Ⅲa受体的信号传导和激活中发挥作用。GRP94抑制剂可显著降低血小板表面活性GPⅡb/Ⅲa受体的表达,显著减少血小板α颗粒的释放。GRP94蛋白主要依靠C-末端二硫键形成同源二聚体并发挥其生物活性。PDI通过完成二硫键的转移和交换来调节细胞的功能。GRP94蛋白C-末端二硫键结合形成的同源二聚体是否依赖PDI调节?目前尚缺少相关研究。但可以肯定的是,细胞内PDI与GRP94的分布与变化具有一致性。外泌体是细胞膜衍生的球状囊泡,在细胞应激条件下形成并包含亲代细胞的活性成分如蛋白质。这些来自于亲代细胞的遗传物质使外泌体具有生物标记的特征。一旦外泌体与靶细胞相连,可通过内吞作用内化,将其内容物转移到细胞质中,从而影响受体细胞生物学功能。血管内皮损伤与内皮细胞活化脱落的内皮细胞来源外泌体（endothelialmicroparticle,EMP）水平密切相关。最近的研究显示,外泌体在血栓性疾病中明显升高,尤其是EMP。静脉血栓的启动涉及血流淤滞、血液高凝状态和血管内皮细胞损伤。血管内皮细胞处于血管的最内层,为血栓形成提供表面,参与血栓形成的机制包括内皮屏障的完整性、内皮细胞与血细胞的相互作用、内皮细胞活化释放促/抑凝物质失衡等。通过研发靶向内皮细胞及其血小板的药物,减少传统抗血栓药物使用过程中的出血风险,是抗血栓形成的新策略。然而血小板的活化是否有内皮来源外泌体的参与,目前尚不清楚。因此,本实验旨在探讨静脉内皮损伤条件下,大量分泌携带PDI的内皮源外泌体调控血小板GRP94表达和GPⅡb/Ⅲa含量表达及构象变化从而影响血栓形成的主要机制。在本研究中,我们以C57/BL6小鼠为研究对象,建立下腔静脉结扎动物模型,构建静脉内皮细胞损伤的体内环境;以静脉内皮细胞为研究对象,置于缺氧条件下,模拟静脉内皮损伤的体内环境,探讨PDI对血小板活化及血栓形成的影响及其可能机制。研究目的1.研究携带PDI的内皮细胞来源外泌体参与静脉血栓发生发展的机制;2.明确以PDI-GRP94-GPⅡb/Ⅲa信号通路为靶点抗血小板活化在VTE防治中的作用。研究方法1.动物造模小鼠麻醉后,将30G胰岛素针头与下腔静脉并行放置,再用一根7-0 prolene缝线在右肾静脉汇入下腔静脉下1cm处结扎,抽出针头后缝合关腹。2.动物分组采用下腔静脉狭窄法造模。10周龄雄性C57/BL6野生型小鼠随机分为4组,分别是假手术组（n=7）、VTE 组（n=9）、VTE+PDI 抑制剂组（n=8）、VTE+GRP94抑制剂组（n=9）。均于13周行下腔静脉狭窄法或假手术造模,术后2天处死小鼠。3.组织病理学检测用苏木素-伊红染色观察血栓形成情况;进行CD41的免疫组织化学染色,计算单位面积上GPⅡb/Ⅲa的表达;进行GRP94、CD41双色免疫荧光染色,计算活化血小板上GRP94的荧光强度。4.流式细胞术检测提取小鼠外周血中乏血小板血浆,进行CD144和PDI双色流式细胞术染色,观察血浆中EMP上PDI的表达情况;提取小鼠外周血中的血小板,进行CD62P、CD41、CD61三色流式细胞术染色,观察血小板活化和GPⅡb/Ⅲa受体表达情况;血小板与静脉内皮细胞共培养10 min后,进行CD62P、CD41、CD61三色流式细胞术染色,观察血小板活化和GPⅡb/Ⅲa受体表达情况。5.细胞造模及分组培养人脐静脉内皮细胞,待静脉内皮细胞培养至第3代,将培养基改为无外泌体血清的内皮细胞专用培养基,将培养皿放置在有机玻璃暴露室中,交替地充入低氧气体混合物（1%O2,5%CO2和平衡N2,缺氧,300秒）或常氧气体混合物（21%O2,5%CO2和平衡N2,充氧,600秒）培养1天,随机分为4组:对照组、缺氧组、缺氧+PDI抑制剂组、缺氧+GRP94抑制剂组。6.外泌体提取和PKH26染色超速离心法提取静脉内皮细胞上清中的外泌体。外泌体PKH26染色后与血小板共孵育10min,通过激光共聚焦显微镜观察外泌体的内吞过程。7.荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）将GFP-GPⅡb（绿色荧光）、mCherry-GPⅢa（红色荧光）过表达质粒载体分别转染到293T细胞,与内皮细胞源外泌体共孵育2h,通过激光共聚焦显微镜观察荧光能量共振转移效率N-FRET值。8.血小板聚集实验血小板与外泌体共孵育10 min,比较PDI抑制剂、GRP94抑制剂干预前后的血小板聚集速率。9.蛋白质分子检测采用Western blot技术检测血小板PDI含量的表达;采用非变性电泳技术检测血小板内GRP94二聚体含量的表达。研究结果1.动物实验结果1.1 VTE小鼠模型建立对照组未发现血栓形成,VTE组小鼠成模率为71%,血栓长度平均标准差为 3.7±3.6 mm。1.2血栓与血小板活化程度呈正相关免疫组织化学染色结果发现,VTE组小鼠血小板活化指标CD41大面积分布于血栓表面;流式细胞术结果显示,与对照组相比,VTE组血小板CD62p表达水平明显升高;VTE组小鼠CD41含量明显增加;ELISA结果显示,与对照组相比,VTE组小鼠外周血中血小板活化指标P选择素含量明显增加。说明血小板活化与静脉血栓形成呈正相关。1.3 PDI和GRP94减少血浆凝血因子含量与对照组比较,VTE组、VTE+PDI抑制剂组、VTE+GRP94抑制剂组P-选择素显著升高,VTE+PDI抑制剂组P-选择素显著低于VTE组。与对照组相比,VTE组和血管性假血友病因子（von willebrand factor,vWF）升高,而VTE+GRP94抑制剂组的vWF含量明显降低。此外,VTE组的纤维蛋白原（Fibrinogen,Fib）水平明显低于对照组,VTE+GRP94抑制剂组和VTE+PDI抑制剂组较VTE组Fib含量增加,但差异无统计学意义。结果1.2和结果1.3表明,PDI抑制剂和GRP94抑制剂可排除凝血水平对血栓形成的影响,使血栓形成仅与血小活化有关。1.4 PDI和GRP94与血栓表面的血小板活化程度呈正相关免疫组织化学染色结果发现,与VTE组相比,VTE+PDI抑制剂组和VTE+GRP94抑制剂组GPⅡb/Ⅲa的平均光密度表达显著降低,说明抑制PDI和GRP94后可使血小板活化程度降低。1.5 PDI和GRP94与血液来源血小板GPⅡb/Ⅲa含量呈正相关流式细胞术结果显示,与VTE组相比,VTE+PDI抑制剂组和VTE+GRP94抑制剂组血小板CD61表达下降。1.6 PDI和GRP94与血栓表面的血小板GRP94水平呈正相关CD41、GRP94免疫双荧光染色发现,与对照组相比,VTE+PDI抑制剂组和VTE+GRP94抑制剂组血栓中GRP94荧光强度明显受到抑制,表明PDI抑制剂和GRP94抑制剂在血小板活化和血栓形成过程中明显抑制GRP94的表达。1.7 EMP携带PDI的含量明显增加与对照组相比,VTE组中EMP上PDI含量明显升高;与VTE组相比,VTE+PDI抑制剂组中EMP上PDI含量明显升高,而VTE+GRP94抑制剂组中EMP上PDI含量未见明显下调。说明下腔静脉结扎后EMP上PDI含量增加,PDI抑制剂可以抑制PDI含量的增加,而不受GRP94抑制剂的影响。2.细胞实验结果2.1 EMP可被血小板摄取PKH26标记EMP与血小板共孵育10 min后,血小板内可见红色的、散在的荧光点即为PKH26标记外泌体,表明EMP可被血小板摄取。2.2 PDI促进血小板GRP94 同源二聚体形成将内皮细胞和血小板共培养10 min。Western blot结果显示,缺氧组血小板PDI含量明显高于对照组,缺氧+PDI抑制剂组血小板PDI含量明显低于缺氧组。非变性电泳结果显示,缺氧组GRP94二聚体含量较对照组显著升高,缺氧+PDI抑制剂组和缺氧+GRP94抑制剂组GRP94二聚体含量较缺氧组显著降低,以上结果均表明血小板GRP94同源二聚体受PDI含量调控。2.3 PDI和GRP94和血小板聚集水平呈正相关与对照组相比,缺氧组的外泌体显著增加血小板聚集率;与对照组相比,PDI抑制剂组和GRP94抑制剂组血小板聚集率明显降低,表明PDI和GRP94与血小板聚集水平呈正相关。2.4 PDI调控血小板表面GPⅡb/Ⅲa的构象变化与对照组相比,加入缺氧来源EMP的293T细胞N-FRET降低,结合动物实验1.5结果,表明PDI影响GPⅡb/Ⅲa的空间构型变化。研究结论1.血小板活化参与静脉血栓形成过程;2.缺氧后,内皮细胞损伤释放出携带PDI的外泌体活化血小板促进静脉血栓形成;3.EMP-PDI被血小板摄取后,促进血小板内GRP94同源二聚体形成,增加血小板表面GPⅡb/Ⅲa表达量,进而活化血小板;4.PDI通过催化GRP94和GPⅡb/Ⅲa受体二硫键形成,导致GRP94形成二聚体,GPⅡb/Ⅲa空间构象改变;5.PDI-GRP94-GPⅡb/Ⅲa受体信号通路在血小板活化促进静脉血栓形成过程中发挥重要作用,以此为靶点可能防治静脉血栓形成。