论文部分内容阅读
目的1.比较三种支架材料β-磷酸三钙(p-TCP)、珊瑚羟基磷灰石(CHA)、冻干同种异体骨(FDBA)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外生物学特性和体内成骨骨量的影响。2.研究不同数量hBMSCs细胞悬液复合β-TCP和CHA支架在体外的生物学特性和TEB体内成骨情况,探讨hBMSCs数量与TEB体内成骨骨量之间的量效关系。3.初步开展应用自体浓缩骨髓血复合β-TCP修复齿槽嵴裂的临床个体化治疗。方法1.应用密度梯度离心结合贴壁法分离培养hBMSCs,并将hBMSCs向成骨细胞、脂肪细胞方向诱导分化。流式细胞技术检测hBMSCs的表面标志物。取P3代hBMSCs在体外构建β-TCP/hBMSCs、CHA/hBMSCs、FDBA/hBMSCs细胞支架复合物,体外成骨诱导2周后植入裸鼠皮下。体外培养的不同时间点检测hBMSCs在支架材料上的粘附、生长、细胞活性、空间分布、基质分泌和成骨相关基因的表达。术后3月取材,Micro-CT和组织学定量检测各组的成骨骨量。2.以β-TCP和CHA为支架材料,使用1μL hBMSCs细胞悬液,不同接种浓度(5×106/mL、10×106/mL、20×106/mL、30×106/mL、50×106/mL)构建TEB,并在体外培养的不同时间点检测hBMSCs在支架材料上的粘附、生长、细胞活性、空间分布、基质分泌和成骨相关基因的表达。体外成骨诱导2周后植入裸鼠皮下,术后3月取材,Micro-CT和组织学定量检测各组TEB的成骨骨量。3.检测自体浓缩骨髓血的生物安全性,明确自体浓缩骨髓血修复骨缺损技术的适应证、禁忌证及可能的风险,制定临床治疗流程并通过伦理委员会、新技术委员会讨论后,于2013年10月至2014年1月,经患者本人或监护人签字同意后,全麻下抽取自体骨髓血,应用密度梯度离心法浓缩骨髓血,复合β-TCP支架修复临床齿槽嵴裂缺损7例,术后不同时间点(3月、6月、1年和2年)行X线和CT检查评价骨缺损修复情况。结果1.hBMSCs在β-TCP组和CHA组的粘附、生长、分布明显优于FDBA组,有统计学差异；FDBA构建的TEB植入体内3月后无新骨生成;β-TCP和CHA构建的TEB体内后可见新骨生成,构建成功率分别为3/4、4/4；成骨面积定量分析结果显示p-TCP组成骨骨量明显高于CHA组。2.以p-TCP为支架构建TEB,接种浓度为10×106/mL及以上浓度时,hBMSCs在p-TCP支架上的生长、活性、分布、基质分泌和成骨分化无显著的统计学差异,但均显著优于5×106/mL组。5×106/mL组在体内无新骨生成；接种浓度为10、20、30和50×106/mL组的TEB体内构建成功率分别为5/7、7/8、6/8和6/8。组织学和Micro-CT定量分析显示30和50×106/mL组TEB的成骨骨量明显高于10和20×106/mL组。因此,采用支架饱和体积(10μL)接种时,TEB达到稳定构建成功率所需的接种浓度是10×106/mL；TEB达到稳定高效成骨的接种浓度是30x106/mL。3.以CHA为支架构建TEB,接种浓度10×106/mL及以上浓度时,hBMSCs在β-TCP支架上的生长、活性、分布、基质分泌和成骨分化无显著的统计学差异,且明显优于10×106/mL组,10×106/mL组又明显优于5×106/mL组。体内TEB样本HE染色结果显示：5×106/mL组无新骨生成；10、20、30和50×106/mL组的TEB体内构建成功率分别为7/8、4/7、6/8和6/8。成骨面积和Micro-CT定量分析显示20、30和50×106/mL组TEB的成骨骨量明显高于10×106/mL组,有统计学差异。因此,采用支架饱和体积(1μL)接种时,构建的TEB达到稳定构建成功率所需的接种浓度是10×106/mL；TEB达到稳定高效成骨的接种浓度是20×106/mL。4.本临床应用研究共纳入7例患者,其中男性2名,女性5名,年龄范围8-27岁。截至2014年2月,全部患者术后均无感染、排斥、外露等并发症出现；其中3名患者术后3月CT复查示骨缺损修复效果良好,其余4名患者仍在随访过程中。结论1.相较于FDBA,β-TCP和CHA支架更适合TEB的构建。2.hBMSCs数量与TEB成骨骨量之间存在量效关系：细胞接种数量低于该支架材料的最低细胞接种量时,TEB植入体内后不能成骨；TEB的成骨骨量随细胞接种数量增加而增加,达到饱和接种量时,TEB体内稳定高效成骨；超过饱和接种量时,TEB成骨骨量无明显增加。3.hBMSCs饱和细胞接种量因支架材料的不同而不同,可能与支架材料本身的特性有关。4.自体浓缩骨髓血复合β-TCP可修复临床齿槽嵴裂。