目的 克隆小鼠M-CSF基因开放阅读框全长序列552个氨基酸，并在真核细胞中表达。方法 (1)提取L929细胞总RNA，RT-PCR扩增M-CSF基因，产物与pGEM-T Easy质粒连接，转化后酶切鉴定，DNA序列分析。（2）将M-CSF基因重组体亚克隆入真核表达载体pEGFP-N3，转化后酶切鉴定。（3）将重组体pEGFP-N3-M-CSF质粒DNA转染CHO细胞，倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光产生情况。收获转染后细胞,提取总RNA，进行RT-PCR，荧光定量PCR检测，用Excel软件对荧光定量PCR结果进行相关性分析。 结果 (1)电泳结果显示RT-PCR产物的长度为1690bp，与预期结果相符。产物纯化、连接、转化后酶切结果提示获取了小鼠M-CSF基因重组质粒pGEM-T Easy-M-CSFa。为了测通插入片段的全序列，采用亚克隆的方法，得到五个阳性重组体EH、EB、SB、SH、SG，测序发现在重组体pGEM-T Easy-M-CSFb第9位缺失了一个G碱基，引起阅读框的错误，在第1093位发生了碱基颠换，由A变成G，其编码的氨基酸由苏氨酸变成丙氨酸。为了修复突变位点，从L929细胞中克隆X、D片段，经测序正确后，与pGEM-T Easy-M-CSFb有突变的片段置换，得到阳性重组体pGEM-T Easy-M-CSF。（2）M-CSF重组体亚克隆入真核表达载体pEGFP-N3，酶切鉴定结果提示，构建成功了M-CSF真核表达质粒pEGFP-N3-M-CSF。（3）转染结果表明,转染成功的细胞在荧光显微镜下观察到了绿色荧光,而未经转染的细胞则不发荧光。约30%的细胞呈现绿色荧光，荧光强弱不等，位于胞核及胞浆内。转染后36h不同比例组均有M-CSF基因的复制表达，4：1（脂质体：质粒DNA v/w）组的表达量明显高于3：1和10：1组。然后以4：1转染细胞，发现转染后从5h开始到72h，各个时相均有表达。从转染后5h到48h表达量逐渐升高，在48h左右表达量最高，然后再逐渐下降。 结论 克隆了小鼠M-CSF基因开放阅读框全长序列，并通过基因改造成功地进行了小鼠M-CSF基因不同突变的纠错，获得了正确的M-CSF基因重<WP=5>组体。建立真核表达体系pEGFP-N3-M-CSF，并在CHO细胞中表达，为进一步研究M-CSF基因的功能和应用提供基础。