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背景和目的: 先天免疫系统被认为是抗病毒感染的第一道防线。病毒感染会激活细胞信号通路,导致细胞因子释放,如干扰素 (IFNs)。IFNs在病毒感染过程中发挥着至关重要的作用。干扰素与细胞表面受体结合,活化干扰素信号通路,诱导干扰素刺激基因 (ISGs) 表达。很多ISGs具有抗病毒能力,但它们的抗病毒机制尚有待深入阐明。Viperin又称cig5或RSAD2,它最初在感染HCMV的原代包皮成纤维细胞中被鉴定。Viperin本底表达水平较低,但多种DNA病毒和RNA病毒能诱导其高表达,诱导表达的Viperin发挥广谱抗病毒效应。但是,Viperin在柯萨奇病毒3型 (CVB3) 感染中的作用尚未报道。病毒性心肌炎 (VMC) 主要由柯萨CVB3导致,CVB3属于小RNA病毒科肠道病毒属。病毒性心肌炎是临床上较为常见的心血管疾病,发病率逐年升高,尤其是儿童和婴幼儿。因此,本文主要探讨Viperin在CVB3病毒感染过程中的作用及其分子机制。 方法: (1)Viperin knockdown (shViperin)质粒转染细胞,随后感染CVB3病毒,采用Western Blot方法或实时荧光定量PCR方法或倒置荧光显微镜研究Viperin对CVB3病毒感染的影响。 (2)采用质谱方法或免疫共沉淀方法或免疫荧光方法探究Viperin与STAT1相互作用;利用Viperin过表达质粒或敲低质粒转染细胞,采用Western Blot方法探究Viperin对STAT1蛋白水平的影响。 (3)Mapping:构建Viperin与STAT1缺失突变体,利用这些突变体转染细胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法研究Viperin与STAT1的结合区域。 (4)利用Viperin过表达质粒转染细胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法研究Viperin对STAT1泛素化水平的影响。 (5)采用质谱方法筛选出与Viperin相互作用的泛素连接酶E3。探究E3连接酶对STAT1蛋白水平和泛素化水平的影响,以及是否依赖于泛素连接酶活性。 (6)用CVB3病毒感染细胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法研究CVB3对STAT1蛋白水平和泛素化水平影响,以及Viperin与STAT1蛋白水平的相关性; 结果: (1)Western Blot方法或实时荧光定量PCR方法或倒置荧光显微镜结果显示:Viperin促进柯萨奇B3病毒 (CVB3) 感染。 (2)采用质谱方法筛选出与Viperin相互作用的抗病毒蛋白STAT1。Western Blot结果显示:Viperin下调STAT1蛋白水平,影响了STAT1蛋白的稳定性。 (3)Mapping结果显示:STAT1结合到Viperin的SAM结构域,并且SAM结构域发挥降解STAT1功能。Viperin结合到STAT1的C末端。 (4)免疫共沉淀和Western Blot结果显示:Viperin泛素化降解STAT1蛋白水平,并且这种降解依赖泛素蛋白酶体系统。 (5)采用质谱和免疫共沉淀方法筛选出与Viperin相互作用的泛素连接酶UBE4A;实验结果显示:Viperin能够增加UBE4A与STAT1相互作用,促进UBE4A泛素化降解STAT1蛋白并依赖于泛素连接酶活性。 (6)CVB3病毒感染细胞不同时间点,采用q-PCR和Western Blot方法检测Viperin和STAT1变化。实验结果显示:CVB3诱导Viperin表达增加,并泛素化降解STAT1蛋白水平,Viperin与STAT1的蛋白水平存在一定的负相关性。 结论: CVB3病毒感染细胞时,诱导Viperin表达增加,Viperin的增加促进了UBE4A与STAT1相互作用,并诱导UBE4A泛素化降解STAT1蛋白,进而负向调控干扰素信号通路,最终促进CVB3病毒感染。